構(gòu)樹花多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

段雪偉，張敏君，王燕，楊慧文，劉冰，由天輝*

（1.廣東藥科大學 護理學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006）

構(gòu)樹[Broussonetia papyrifera（L.）Vent]，別名褚桃，為桑科構(gòu)屬落葉喬木，分布于我國華北、華中、華南、西南、西北等地區(qū)[1]。研究表明構(gòu)樹皮和葉中含有豐富的黃酮和生物堿類成分，具有抗炎抑菌[2]、抗病毒[3]、抗腫瘤[4]等功效，構(gòu)樹花提取物可以抗衰老，對皮膚炎癥也有較好的作用[5]。構(gòu)樹花分為雄花和雌花，雌花授粉形成果實，雄花脫落被大量丟棄。構(gòu)樹雄花富含多糖類物質(zhì)，有食用的傳統(tǒng)，安全性較高，且構(gòu)樹雄花花序繁茂，數(shù)量可觀、來源廣泛，具有潛在的開發(fā)價值。

多糖是一種廣泛分布于自然界中的高分子聚合物，是構(gòu)成動植物細胞的重要組成部分，并參與細胞的代謝及生理調(diào)節(jié)[6]。植物多糖是一種特殊的生物活性物質(zhì)，具有無毒、無害、安全性高等優(yōu)點，備受國內(nèi)外學者青睞，大量研究表明植物多糖具有抗氧化[7]、抗炎[8]、調(diào)節(jié)免疫[9]、降血脂[10]等生理功效。目前，提取植物多糖的方法包括熱水浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和酶法等，其中超聲輔助提取法的原理是利用超聲波的空化作用，增大植物細胞壁的通透性，加速多糖的析出，達到減少提取時間、提高多糖得率的目的[11]。

目前，國內(nèi)外對構(gòu)樹花研究還鮮少報道，構(gòu)樹花資源沒有被充分利用，因此本文以構(gòu)樹雄花為研究對象，通過超聲輔助提取其活性多糖，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對提取工藝條件進行優(yōu)化，并分析構(gòu)樹花多糖的體外抗氧化活性，旨在為深入挖掘構(gòu)樹花的綜合利用價值提供試驗依據(jù)，并對開發(fā)具有生物活性的多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

構(gòu)樹花：采自安徽省亳州市，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院程軒軒教授鑒定為桑科構(gòu)屬植物構(gòu)樹的雄花序；2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis -（3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulphonate），ABTS]、抗壞血酸：美國Sigma 公司；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、葡萄糖、亞硫酸鉀、水楊酸、FeSO4、H2O2、鄰苯三酚、鹽酸：天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器

KQ-3200 DB 超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；JC-TP 1204 型萬分之一電子天平：青島精誠儀器儀表有限公司；XWK-V108S 酶標儀：東莞西瓦卡精密量儀有限公司；YRE-5299 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器：河南佰年儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)樹花多糖提取工藝

將構(gòu)樹花烘干、粉碎后過60 目篩，準確稱取構(gòu)樹花粉末2.00 g，按照料液比1 ∶30（g/mL）、超聲功率80 W、提取溫度65 ℃、提取時間80 min、提取2 次，合并提取液，過濾、濃縮、定容至50 mL，加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置24 h，收集沉淀，冷凍干燥得構(gòu)樹花多糖。配制成5 mg/mL 的構(gòu)樹花多糖溶液，備用。

1.3.2 單因素試驗

考察料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]、超聲功率（60、80、100、120、140 W）、提取溫度（60、65、70、75、80 ℃）、提取時間（20、40、60、80、100 min）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5）和乙醇濃度（65%、70%、75%、80%、85%）對構(gòu)樹花多糖得率的影響。考察某一因素時其他因素固定條件為料液比1 ∶30（g/mL）、超聲功率80 W、提取溫度65 ℃、提取時間80 min、提取2 次、乙醇濃度75%。

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken 設計原理[12]，以構(gòu)樹花多糖得率為響應值，選取4 個對響應值影響較大的因素（料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間）為自變量，進行響應面分析。響應面試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.4 構(gòu)樹花多糖含量的測定方法

1.3.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制

參考Chen 等[13]的方法，采用苯酚-濃硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖溶液作為標準溶液，葡萄糖濃度為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，得到回歸方程為Y=2.018 7X+0.022 4（R2=0.992 4）。

1.3.4.2 多糖含量的測定

精密吸取一定體積的5 mg/mL 構(gòu)樹花多糖溶液，根據(jù)標準曲線得到多糖含量，再按公式（1）計算出構(gòu)樹花多糖得率（W，%）。

式中：C 為樣品溶液中構(gòu)樹花多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為測定液總體積，mL；D 為樣品溶液稀釋倍數(shù)；M 為構(gòu)樹花粉末原料質(zhì)量，g。

1.3.5 構(gòu)樹花多糖體外抗氧化活性測定

1.3.5.1 構(gòu)樹花多糖對ABTS+自由基的清除作用

參考Huang 等[14]的方法，配制ABTS 溶液。向1 mL構(gòu)樹花多糖溶液（質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL）加入6 mL ABTS 溶液，在30 ℃水浴中充分避光反應6 min，于734 nm 處檢測不同濃度構(gòu)樹花多糖吸光度Ax，以純水代替ABTS 溶液測吸光度Ay，以純水代替構(gòu)樹花多糖溶液測吸光度A0。以同濃度抗壞血酸作為對照，按公式（2）計算ABTS+自由基清除率（E，%）。

1.3.5.2 構(gòu)樹花多糖對羥自由基的清除作用

參考Zan 等[15]的方法，采用水楊酸法測定構(gòu)樹花多糖對羥自由基的清除能力。向2 mL 構(gòu)樹花多糖溶液（質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL） 內(nèi)分別加入2 mL FeSO4溶液、2 mL 水楊酸溶液混勻后靜置10 min，再加2 mL H2O2溶液后置于37 ℃水浴鍋內(nèi)反應0.5 h，510 nm 處測吸光度Ax，用純水代替H2O2溶液測吸光度Ay，用純水代替構(gòu)樹花多糖溶液測吸光度A0。以同濃度抗壞血酸作為對照，按公式（3）計算羥自由基清除率（F，%）。

1.3.5.3 構(gòu)樹花多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

參考Chen 等[16]的方法測定構(gòu)樹花多糖對超氧陰離子自由基的清除能力。向2 mL 構(gòu)樹花多糖溶液（質(zhì)量濃度為0.4～4.0 mg/mL） 中加入4.5 mL Tris-HCl 溶液，置于25 ℃水浴鍋內(nèi)充分反應20 min，再加0.4 mL鄰苯三酚溶液，靜置5 min 后加0.1 mL HCl 停止反應，在325 nm 處檢測溶液吸光度Ax，以純水代替鄰苯三酚測得吸光度Ay，以純水代替構(gòu)樹花多糖溶液測吸光度A0。以同濃度抗壞血酸作為對照，按公式（4）計算超氧陰離子自由基清除率（G，%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3 次，單因素試驗數(shù)據(jù)運用Graph-Pad Prism 8 進行分析，響應面試驗采用Design-Expert 8.6 軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對多糖得率的影響

料液比對構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖1。

圖1 料液比對構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖1 可知，隨溶劑體積增大，多糖得率先是逐漸上升，當料液比為1 ∶40（g/mL）時，多糖得率達5.49%，而后逐漸下降。這可能是因為當所用溶劑較少時，溶液濃度較大，多糖溶出不完全，得率較低，增大溶劑體積可以增加構(gòu)樹花與純水的接觸面積，利于多糖析出；繼續(xù)增大純水用量，可能會導致蛋白質(zhì)等非多糖物質(zhì)溶出，從而影響多糖含量，此外，溶劑體積的增加會延長后期高溫濃縮時間，造成多糖分子結(jié)構(gòu)破壞，也會降低多糖得率[17]。因此，選擇料液比為1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.2 超聲功率對多糖得率的影響

超聲功率對構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖2 可知，超聲功率較低時，構(gòu)樹花多糖得率隨超聲功率增大呈現(xiàn)明顯增勢，并在功率為100 W 時得率達到峰值5.78%。因為超聲波有助于破壞植物細胞結(jié)構(gòu)，促進多糖釋放；當超聲波功率較大時，多糖糖苷鍵會被超聲波破壞，使多糖降解率大于多糖的析出率[18]，降低多糖得率。因此，選擇超聲功率為80、100、120 W進行后續(xù)試驗。

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響

提取溫度對構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖3 可知，在溫度低于70 ℃時，多糖得率隨提取溫度升高而增加，當溫度為70 ℃時，多糖得率最高，達到6.06%。升高溫度可以可加速構(gòu)樹花中多糖的運動，有利于多糖的析出；提取溫度超過70 ℃時，多糖結(jié)構(gòu)會被高溫破壞[19]。因此，選擇提取溫度為65、70、75 ℃進行后續(xù)試驗。

2.1.4 提取時間對多糖得率的影響

提取時間對構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖4 可知，提取低于60 min 時，多糖得率隨著提取時間的延長而升高，提取60 min 時，多糖得率最高，達到5.41%；因為提取時間太短時，多糖無法充分析出，超過60 min 時，大部分多糖已被提取出來，繼續(xù)提取，多糖中的雜質(zhì)析出使多糖得率下降[20]。因此，選擇提取時間為40、60、80 min 進行后續(xù)試驗。

2.1.5 提取次數(shù)對多糖得率的影響

提取次數(shù)對構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖5。

圖5 提取次數(shù)對構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖5 可知，提取2 次時，多糖得率達到5.21%，提取3～5 次時，隨著次數(shù)增加構(gòu)樹花多糖得率反而減少。可能是因為提取2 次時，大部分多糖已經(jīng)被提取出來[21]，多次提取也會增加后期濃縮時間。因此，將最佳提取次數(shù)確定為2 次。

2.1.6 乙醇濃度對多糖得率的影響

乙醇濃度對構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖6。

圖6 乙醇濃度對構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖6 可知，乙醇濃度低于75%時，多糖得率隨乙醇濃度增加而升高，乙醇濃度為75%時，多糖得率為5.21%，隨后趨于平緩。乙醇濃度為75%時，此時大部分多糖已經(jīng)溶出[22]，繼續(xù)增加乙醇濃度，無法提高多糖得率，又會造成試劑的浪費。因此，將最佳乙醇濃度確定為75%。

2.2 響應面設計結(jié)果與分析

利用響應面軟件Design Expert 8.6 進行四因素三水平的試驗，設計方案見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及試驗結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗

以構(gòu)樹花多糖得率（Y）為考察響應指標，建立其與料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間4 個因素的回歸模型，得到二次回歸方程為Y=6.55+0.181 1A+0.123B-0.116 6C+0.101 9D+0.136 8AB+0.001 9AC+0.314 9AD-0.29BC-0.078 9BD-0.077CD-0.466 8A2-0.523 3B2-0.265 1C2-0.441D2。

由表3 可以看出，該回歸模型P<0.000 1，具有高度顯著性，模型總決定系數(shù)R2=0.962 6，R2Adj=0.925 2，表明有92.52%的試驗值可用該模型預測，試驗誤差較小，能準確反映4 個因素對構(gòu)樹花多糖得率的影響。此外A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、AD、BC 項的P<0.01，影響極顯著；AB 項的P<0.05，具有顯著性影響，而AC、BD、CD 的P>0.05，對指標無顯著影響。比較F 值得出各因素對構(gòu)樹花多糖得率的影響大小為料液比>超聲功率>提取溫度>提取時間。

2.2.2 響應面分析

各個因素及其相互作用對構(gòu)樹花多糖得率的影響的3D 響應面如圖7 所示。

圖7 各因素交互作用對構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.7 Response surface plot of the effect of each factor on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

兩因素之間的交互作用是否顯著可以從等高線形狀看出，等高線為橢圓形，說明兩因素交互作用對構(gòu)樹花多糖得率影響顯著[23]。從圖7 可以看出，AB、AD、BC 的等高線為橢圓形，說明構(gòu)樹花多糖得率受料液比和超聲功率、料液比和提取時間、超聲功率和提取溫度的影響顯著，與上述方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗證試驗

通過分析回歸模型可知，采用超聲波輔助提取構(gòu)樹花多糖的最佳條件：料液比1 ∶43.123（g/mL），超聲功率104.967 W，提取溫度68.055 ℃，提取時間64.807 min，此最優(yōu)條件下構(gòu)樹花多糖得率的預測值為6.63%。為驗證結(jié)果可靠性，結(jié)合實際提取試驗可行性，調(diào)整最終構(gòu)樹花多糖提取條件：料液比1 ∶43（g/mL），超聲功率105 W，提取溫度68 ℃，提取65 min，重復試驗5 次，此最優(yōu)提取工藝條件下，構(gòu)樹花多糖得率為6.66%，與預測結(jié)果接近，證明該試驗模擬準確、有效，適用于構(gòu)樹花多糖的提取。

2.3 體外抗氧化活性結(jié)果與分析

2.3.1 構(gòu)樹花多糖對ABTS+自由基的清除能力

構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對ABTS+自由基的清除作用見圖8。

圖8 構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對ABTS+自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers and ascorbic acid on ABTS+ free radicals

如圖8 所示，在試驗配制的多糖濃度范圍內(nèi)，構(gòu)樹花多糖對ABTS+自由基表現(xiàn)出非常強的清除能力，且ABTS+自由基清除率與多糖濃度呈劑量效應關系。當構(gòu)樹花多糖濃度為2.0 mg/mL 時，清除率可達94.83%，此時構(gòu)樹花多糖的ABTS+自由基清除能力與抗壞血酸的最大清除能力接近，經(jīng)線性擬合得出構(gòu)樹花多糖對ABTS+自由基清除率的半抑制濃度（IC50）為0.47 mg/mL，說明構(gòu)樹花多糖對ABTS+自由基表現(xiàn)出極好的清除能力。

2.3.2 構(gòu)樹花多糖對羥自由基的清除能力

構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對羥自由基的清除作用見圖9。

圖9 構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對羥自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effects of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers and ascorbic acid on hydroxyl radicals

如圖9 所示，構(gòu)樹花多糖對羥自由基清除能力隨多糖濃度升高而提高，當構(gòu)樹花多糖濃度升至2.0 mg/mL時，清除率達到88.3%，經(jīng)線性擬合得出構(gòu)樹花多糖對羥自由基的IC50值為0.76 mg/mL，具有較強的羥自由基清除能力。

2.3.3 構(gòu)樹花多糖對超氧陰離子自由基的清除能力

構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除作用見圖10。

圖10 構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effects of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers and ascorbic acid on superoxide anion radicals

如圖10 所示，構(gòu)樹花多糖對超氧陰離子自由基清除能力與多糖濃度呈正比，濃度為4.0 mg/mL 時，清除率達到83.9%，經(jīng)線性擬合得出構(gòu)樹花多糖對超氧陰離子自由基的IC50為2.47 mg/mL，在試驗濃度范圍內(nèi)，相比較抗壞血酸，雖然構(gòu)樹花多糖對超氧陰離子自由基的清除率較弱，但仍表現(xiàn)出一定的清除能力。

3 結(jié)論

本試驗優(yōu)化了超聲波提取構(gòu)樹花多糖的條件，通過對料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間4 個因素的考察與響應面分析，得到構(gòu)樹花多糖的最優(yōu)提取條件：當料液比1 ∶43（g/mL）時，在超聲功率105 W 和提取溫度68 ℃條件下，提取65 min，構(gòu)樹花多糖得率為6.66%。此外，對提取的構(gòu)樹花多糖進行了體外抗氧化活性分析，結(jié)果顯示，構(gòu)樹花多糖對ABTS+自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.47、0.76 mg/mL 和2.47 mg/mL，其結(jié)果弱于抗壞血酸。

綜上所述，采用超聲輔助提取法可有效提高構(gòu)樹花多糖的得率，所得構(gòu)樹花多糖體外抗氧化活性較強，可作為天然抗氧化劑應用于醫(yī)療或化妝品等領域，該結(jié)果可為提高構(gòu)樹花的利用價值提供參考。