黃果梨果酒制備工藝優化

韋唯，葉英，2*，蘭麗虹，王紅，王樹林

（1.青海大學 農牧學院，青海 西寧 810016；2.青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，青海 西寧 810016）

黃果梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）為白梨系統的地方梨品種，一般為鵝卵形狀，顏色呈金黃色，果皮薄而松軟，經自然成熟采摘后-20 ℃冷凍，此過程對色澤影響較小，但目前關于果實其它品質影響的研究鮮見。青海省同仁縣是黃果梨的主產地，主要分布在隆務鎮、保安鎮、年都乎鄉等沿隆務河的山水地區。目前，隆務河谷地帶黃果梨種植地有297 077 株[1]。由于特殊的地理環境極大地促進了植物光合作用與干物質積累，黃果梨營養價值較高，口感濃郁純正。黃果梨中含有水分、氨基酸、總糖、總酸、類胡蘿卜素等多種營養成分且含量豐富，并含有多種礦物質元素及各種微量元素[2]。此外，黃果梨果實具有獨特的保健功能，如清熱解毒、化痰利肺。可將其作為天然綠色保健品的優質原材料，因而極具開發潛力[3]。

黃果梨酒是一種由果酒酵母發酵而成的功能性果酒。功能性果酒富含多種營養物質如有機酸及維生素等[4-5]，適量飲用有利于促進血液循環。研究發現李子酒、刺梨酒中含多種生物活性成分且刺梨酒中含有豐富的超氧化物歧化酶[6-7]。陳珍等[8]研究表明刺梨果酒可有效預防高脂誘導小鼠肥胖。李少鵬等[9]研究表明枸杞果酒具有提高機體免疫機能、促進機體健康等功效。青海地區黃果梨資源豐富，但對黃果梨果酒的研究鮮見。因此本文以黃果梨為發酵原料制作果酒，以期為黃果梨資源的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黃果梨：青海省同仁縣；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級）：山東中天生物科技有限公司；白砂糖：鄄城縣永泰糖業有限公司。

1.2 儀器與設備

ESJ110-48 電子天平：上海上平儀器有限公司；BPH9052 電熱恒溫培養箱、HH-4S 電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；酒精計：東莞市科銳儀器科技有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；H/T16MM 臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 黃果梨果酒制備工藝

1.3.1 工藝流程

原料處理→手動破碎→去核→果膠酶酶解→添加偏重亞硫酸鉀→加糖→酵母活化→酒精發酵→過濾→澄清→滅菌裝瓶。

1.3.2 操作步驟

1）原料處理：黃果梨從-20 ℃冰箱中取出，15 ℃冷水快速沖洗解凍，剔除霉爛果實，手動破碎去核，打漿。

2）果膠酶酶解：向上述果漿添加0.05%的果膠酶，45 ℃酶解3.5 h。

3）添加偏重亞硫酸鉀：將0.013%的偏重亞硫酸鉀添加至酶解后的黃果梨果漿中。

4）酵母活化：參考文獻[9]的方法，稱取一定量酵母于錐形瓶中，添加酵母添加量10 倍糖度為6 的用新制蒸餾水配制的糖水。緩慢攪拌5 min，在35 ℃恒溫水浴活化20 min。

5）酒精發酵：在24～32 ℃條件下發酵5～9 d。

6）過濾、滅菌：發酵停止后，將發酵瓶中清酒與底部部分沉淀的酵母、果渣等用紗布分離、過濾處理。對發酵酒液進行巴氏滅菌處理。

7）陳釀：將黃果梨酒液置于4 ℃條件下陳釀30 d，使酒味協調，風味濃郁。

1.4 黃果梨果酒發酵工藝優化單因素試驗

1.4.1 發酵溫度對黃果梨果酒的影響

固定菌種接種量為0.05%、初始糖添加量為25%、65 ℃滅菌15 min 條件下。調整發酵溫度（24、26、28、30、32 ℃）發酵7 d，考察發酵溫度對黃果梨果酒的影響。

1.4.2 菌種接種量對黃果梨果酒的影響

固定發酵溫度為28 °C、初始糖添加量為25%、65 ℃滅菌15 min 條件下。調整菌種接種量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）發酵7 d，考察菌種接種量對黃果梨果酒的影響。

1.4.3 初始糖添加量對黃果梨果酒的影響

固定菌種接種量為0.05%，發酵溫度為28 ℃，在65 ℃滅菌15 min 條件下，調整初始糖添加量（15%、20%、25%、30%、35%）發酵7 d，考察初始糖添加量對黃果梨果酒的影響。

1.4.4 發酵時間對黃果梨果酒的影響

固定菌種接種量為0.05%，發酵溫度為28 ℃，初始糖添加量為25%，65 ℃滅菌15 min 條件下，調整發酵時間（5、6、7、8、9 d），考察發酵時間對黃果梨果酒的影響。

1.5 黃果梨果酒發酵工藝優化響應面試驗

Box-Behnken 試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.6 黃果梨果酒感官評定及物質成分變化檢測

1.6.1 感官評定

選15 名食品專業人員組成一個黃果梨果酒感官評定小組對黃果梨果酒進行評價。感官評價標準見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria

1.6.2 檢測方法

總糖含量參照韋璐等[10]的方法，采用蒽酮-硫酸法進行測定；還原糖含量采用直接滴定法進行測定；總酸含量參照楊芳等[11]的方法，采用酸堿滴定法進行測定；多酚含量參考吳曉青等[12]的方法，以沒食子酸為標品進行測定；黃酮含量參考李德森等[13]的方法，以蘆丁為標品進行測定；VC含量參考劉榮森[14]的方法，以抗壞血酸為標品進行測定；酒精度利用果酒專用酒精計進行測定；糖度利用手持糖度計進行測定。

1.7 數據處理

利用Design-Expert V8.0.6、Microsoft Office Excel 2007 和Origin 2018 軟件對試驗進行設計與數據分析，每組試驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度單因素試驗結果

發酵溫度對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響見圖1。

圖1 發酵溫度對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖1 可知，隨著發酵溫度的升高，酒精度與感官評分均呈現先上升后下降的趨勢。主要原因可能是當發酵溫度低于28 ℃時，由于未達最佳發酵條件，導致酵母菌的生長繁殖速率緩慢，黃果梨果酒含糖量過高，口味偏甜，口感較差。當發酵溫度高于28 ℃時，酵母發酵迅速，代謝加快導致其容易衰老，使酒精度降低[15]，另黃果梨發酵不完全，果酒缺乏酒香味。綜上，選擇發酵溫度26～30 ℃進行后續響應面試驗。

2.2 菌種接種量單因素試驗結果

菌種接種量對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響見圖2。

圖2 菌種接種量對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響Fig.2 Effect of yeast addition on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖2 可知，酒精度與感官評分均呈現先上升后下降的趨勢，主要原因可能是當酵母菌接種量小于0.05%時，黃果梨果漿發酵不完全，導致酒精度較低且果酒具有酸味；當菌種接種量大于0.05%時，黃果梨果漿發酵迅速，短時內發酵體系中酒精含量急速增加，在此情況下因酒精含量超過酵母的耐受能力導致部分酵母發生衰老和死亡[16]。果酒也會因此而具有酵母味，使感官評分降低。綜上，選擇菌種接種量0.04%～0.06%進行后續響應面試驗。

2.3 初始糖添加量單因素試驗結果

初始糖添加量對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響見圖3。

圖3 初始糖添加量對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響Fig.3 Effect of initial sugar addition on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖3 可知，糖作為酒精發酵所需的營養物質對整個發酵過程有重要的影響。當初始糖添加量為15%、20%時，果酒口感酸澀。并且酒精度與感官評分相對較低，這主要是因為發酵體系中缺乏糖類營養物質。初始糖添加量為25%時果酒的酒精度為12.7% vol，感官評分為88.85，果酒香味濃郁。當初始糖添加量超過25%時，酒味刺鼻掩蓋了黃果梨的清香。綜上得知，選擇初始糖添加量20%～30%進行后續響應面試驗。

2.4 發酵時間單因素試驗結果

發酵時間對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響見圖4。

圖4 發酵時間對黃果梨果酒酒精度及感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖4 可知，當發酵時間為5～6 d 時，發酵體系中總糖含量較低，致使酒精度與香氣成分積累不足，果酒在酒精度與感官評分方面略有不足；當發酵時間過長為8～9 d 時，酒精含量雖能達到最大程度積累但酵母菌生長代謝受阻，此時會代謝產生各種不良產物且出現輕微的酸敗現象，進而影響酒體口感，致使感官評分大大降低。因此選擇7 d 為黃果梨果酒最佳的發酵時間。

2.5 響應面試驗結果及方差分析

黃果梨果酒發酵響應面試驗結果見表3，方差分析見表4。

表3 響應面試驗結果與分析Table 3 Response surface test results and analysis

表4 響應面試驗方差分析結果Table 4 Variance analysis result of response surface test

黃果梨果酒釀造工藝參數的回歸方程為Y=89.90-1.50A-1.12B+1.88C+1.25AB+1.75AC-2.00BC-2.65A2-6.90B2-5.90C2。

由表4 可知，該模型適合黃果梨果酒釀造工藝試驗的預測。通過顯著性檢驗可知，除了B、AB、AC 對感官評分顯著（P＜0.05），BC 不顯著，其余均為極顯著。對黃果梨果酒感官評分影響強弱的順序為初始糖添加量＞發酵溫度＞菌種接種量。

2.6 交互作用分析

各因素交互作用的響應面與等高線見圖5。

圖5 兩因素交互作用的響應面及等高線Fig.5 Response surfaces and contour lines of interaction between each two factors

由圖5 可知，AB、AC 等高線趨于橢圓，表明交互作用明顯[17]，對黃果梨果酒感官評分影響較大；而BC交互作用不明顯，對黃果梨果酒感官評分影響較小。

2.7 營養及功能成分變化檢測結果

2.7.1 發酵過程中總糖含量變化

總糖含量在黃果梨果酒的口感風味、色澤和穩定性方面有著重要作用[18]。黃果梨果酒中總糖含量的變化如圖6 所示。

圖6 黃果梨果酒發酵過程中總糖含量變化Fig.6 Changes of total sugar content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖6 可知，隨著發酵時間的延長，1～5 d 總糖含量急速下降，主要原因是初期發酵液營養豐富，酵母活力旺盛，在此條件下快速消耗總糖用于酵母自身生長繁殖以及代謝產生酒精；而從第7 天開始總糖降低速率減緩，主要是由于酒精度升高，酵母老化、發酵環境發生改變。發酵7 d 時黃果梨果酒總糖含量為28 g/L，屬半甜型果酒。結合單因素及響應面結果可知總糖含量對黃果梨果酒的酒精度與感官評分有著重要的影響。

2.7.2 發酵過程中還原糖含量變化

黃果梨果酒中還原糖含量的變化如圖7 所示。

圖7 黃果梨果酒發酵過程中還原糖含量變化Fig.7 Changes of reducing sugar content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖7 可知，隨著發酵時間的延長，還原糖含量在發酵過程中呈現先上升后下降的趨勢。0～1 d 內上升的原因主要是白砂糖在酵母中相應酶的作用下分解產生還原糖；3～5 d 內急速下降，主要原因是酵母活力旺盛，整個發酵體系處于主發酵期；5～9 d 內下降趨勢減緩，主要原因可能是發酵體系中缺乏發酵底物，且因發酵過程中產生大量的代謝產物，酵母代謝受抑制，分解糖分能力大大下降。

2.7.3 發酵過程中酒精度、糖度變化

黃果梨果酒中酒精度、糖度的變化如圖8 所示。

圖8 黃果梨果酒發酵過程中酒精度、糖度變化Fig.8 Changes of alcohol content and sugar during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖8 可知，在整個發酵過程中，酒精度與糖度整體表現出相反的變化趨勢。黃果梨原料糖度為12 °Bx，通過添加白砂糖使發酵液初始糖度為30 °Bx。發酵0～1 d 時因酵母需要適應發酵環境，所以酒精度基本不變。發酵第1～3 天時，發酵液中的糖類被酵母用于自身生長繁殖及無氧發酵，酒精度快速增加，糖度持續降低。3～7 d 發酵過程中酒精度平穩上升，此過程也是各種活性成分積累的最佳時間；從第7 天開始酒精度逐漸趨于平緩并達到最大值13.8% vol，糖度則為21.23 °Bx，這主要與酵母的生長代謝受阻有關。發酵體系中糖類被消耗，無法提供充足的營養物質，且此時發酵液的pH 值以及發酵液中過高的酒精度都會對酵母的生長帶來不利影響，導致后期酒精度增加緩慢甚至趨于降低。

2.7.4 發酵過程中VC含量變化

黃果梨果酒中VC含量的變化如圖9 所示。

圖9 黃果梨果酒發酵過程中VC 含量變化Fig.9 Changes of VC content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖9 可知，在整個發酵過程中，VC含量總體呈現先下降后上升的趨勢。主要原因可能是由于酵母細胞在發酵初期進行有氧呼吸，生長繁殖而產熱，致使整個發酵體系溫度較高，導致VC分解[19]。在第7 天時上升至8.436 g/L，VC含量基本達到最大值。

2.7.5 發酵過程中黃酮、多酚含量變化

黃果梨果酒中黃酮、多酚含量的變化如圖10 所示。

圖10 黃果梨果酒發酵過程中黃酮、多酚含量變化Fig.10 Changes of flavone and polyphenol contents during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖10 可知，在整個發酵過程中，黃酮、多酚含量變化趨勢基本一致，均先上升后下降。主要原因是發酵前期，隨著黃果梨果酒中酒精含量的不斷積累，導致黃酮和多酚的浸提量不斷增加，在5 d 時均達到最大值，分別為0.943 5、6.669 mg/L；發酵后期，黃酮、多酚含量明顯降低，分析原因可能是多酚類物質因貯藏溫度、含氧量及果實成分等外界因素的改變而分解[20]。但相比最初值含量都明顯增加，說明發酵有利于黃酮、多酚等活性成分的保留。

2.7.6 發酵過程中總酸含量變化

總酸含量與黃果梨果酒的感官品質密切相關[21]。黃果梨果酒中總酸含量的變化如圖11 所示。

圖11 黃果梨果酒發酵過程中總酸含量變化Fig.11 Changes of total acid content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖11 可知，在整個發酵過程中，總酸含量呈現逐步上升的趨勢。主要原因是黃果梨本身酸性成分含量較高，且在發酵過程中酵母細胞自身代謝產酸，以及因外界高糖環境激發的細胞代謝產酸的應激效應所產生的酸[22]。在整個發酵過程中應密切關注其含量變化以更好控制黃果梨果酒的感官品質。

3 結論

本研究以響應面法優化黃果梨果酒的制備工藝，并通過測定發酵過程中總糖、還原糖、酒精度、糖度、VC、黃酮、多酚、總酸含量等，對黃果梨果酒品質進行評價。得到最佳發酵工藝條件：發酵溫度28 ℃、初始糖添加量25%、菌種接種量0.05%、發酵時間7 d。此條件下制得的黃果梨果酒感官評分達92，酒精度達13% vol。酒體澄清，有光澤。黃果梨果酒發酵過程中，隨著發酵時間的延長及酒精度的增大，半甜型黃果梨果酒總糖、還原糖、糖度等最終含量均降低。黃酮、多酚含量呈現先上升后緩慢下降的變化趨勢，總酸含量整體上升。VC含量相比發酵第1 天增加4.345 g/L。綜上可知，活性物質成分的積累與酒精含量變化有著密不可分的關聯?？梢酝ㄟ^嚴格把控發酵條件，密切關注酒精含量變化，達到各種營養及功能物質富集的目的。本試驗為黃果梨果酒的釀造工藝提供科學依據。