明太魚膠原蛋白提取工藝優化及其體外抗氧化活性

辛炫英，李美瑤，張雨嫣，胡竹子，陳子，王妍

（延邊大學，吉林 延吉 133000）

明太魚，學名黃線狹鱈（Theragra chalcogramma），是鱈形目鱈科鱈屬。主要分布于朝鮮半島東岸、日本北部、韃靼海峽、白令海周緣、鄂霍次克海中部和阿拉斯加等[1]。隨著食品產業日益壯大，尤其是海洋產品加工業的發展，人們開始重視海洋資源的綜合利用，對海洋魚類副產物加工提出了更高的要求，因此，魚類廢棄物的開發利用顯得越來越重要。明太魚是我國延邊朝鮮族自治州最受歡迎的食物之一，魚干產量大。但在明太魚加工過程中副產物資源浪費嚴重，其中魚皮占比最高，總計每年約5 萬t 的魚皮被浪費[2]。

相關研究表明，魚類副產品可被用作獲取膠原蛋白或膠原蛋白水解物的來源材料，以提高海洋生產鏈的價值。由于人們對膠原蛋白的潛在健康益處越來越感興趣，近年來，全球食品行業對膠原蛋白產品的需求正在增加，膠原蛋白帶來的健康益處，包括抗氧化作用、基質金屬蛋白酶抑制作用、血管緊張素轉換酶抑制作用和抗衰老活性等。這些促進健康的特性與膠原蛋白密切相關[3-5]。目前研究表明，制備膠原蛋白主要有熱水浸提法、酸浸提取法、堿浸提取法、酶溶解提取法和鹽析溶解提取法等。其中酶溶解提取法目前已經被廣泛應用于魚皮膠原蛋白的提取，常用的酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等[6-8]。在選擇酶法處理過程中，對溫度和pH 值等條件要求較高，因此本研究利用單因素試驗及響應面優化試驗確定明太魚膠原蛋白提取最佳工藝，同時鑒定其基本性質，最后初步研究其體外抗氧化作用，以期為解決明太魚副產物浪費問題以及生產加工膠原蛋白系列產品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明太魚干皮：市售；胃蛋白酶（1 500 U/g）、番紅花紅、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS -PAGE）試劑盒、乙二胺四乙酸鐵鈉、冰乙酸、氫氧化鈉、正丁醇、氯化鈉、濃鹽酸、異硫氰酸苯酯、三乙胺、乙醇、醋酸鈉、正己烷、抗壞血酸、丁基羥基茴香醚：北京索萊寶科技有限公司。18 種氨基酸標準品（純度均≥97 %）：上海安譜實驗科技股份有限公司。除特殊標記外，其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CT15RT 臺式高速冷凍離心機：中國天美科學儀器有限公司；ZTJZ-200S 均質機：上海眾托實業有限公司；YK759CRT900 紫外分光光度計：賽默飛世爾科技公司；IR Prestige-21 傅里葉變換紅外光譜儀：日本島津公司；ZTJZ-200S 均質機：上海眾托實業有限公司；LC-20 Agilent1260 液相色譜儀：上海怡賽科學儀器有限公司；ZF-288 凝膠成像儀：上海金鵬分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠原蛋白制備

參照王艷[9]的方法并加以改進，取一定量的明太魚魚皮，去離子水除去皮上雜質。將魚皮浸泡在含有0.02 mol/L NaOH 的7.5% NaCl 溶液中，同時進行磁力攪拌，持續18 h，再使用10%正丁醇溶液對除去雜質蛋白后的明太魚魚皮漂洗5 次，每次1 h。水沖至中性，烘干備用。隨后采用胃蛋白酶法提取膠原蛋白，將預處理好的魚皮剪碎，加入純水，料液比為1 ∶20（g/mL），加入1 500 U/g 胃蛋白酶，在45 ℃恒溫水浴鍋中水浴4 h 提取明太魚皮膠原蛋白。雜質去除干凈后加入5%干皮質量的活性炭和氯化鈣，以此來達到脫色除味的目的。在60 ℃恒溫水浴鍋中將混合液靜止沉淀20 min，收集上清液后，再用800 目濾布進行過濾，將活性炭及雜質去除。濾液與上清液合并，6 000 r/min 離心20 min，棄去沉淀。將純化的膠原蛋白溶液放在培養皿中。

1.3.2 膠原蛋白得率測定

膠原蛋白中存在一種特有氨基酸，為羥脯氨酸，通過測定羥脯氨酸含量可以得出膠原蛋白含量，方法參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》[10]。按公式（1）計算膠原蛋白得率。

式中：X1為膠原蛋白得率，%；M1為上清液羥脯氨酸含量，%；M2為魚皮羥脯氨酸含量，%。

1.3.3 單因素試驗設計

以膠原蛋白得率為指標，分別考察反應時間、料液比、酶用量、反應溫度4 個單因素對明太魚膠原蛋白得率的影響。各因素水平設置為反應時間選擇2、3、4、5、6 h；料液比選擇1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）；酶用量選擇300、600、900、1 200、1 500、1 800 U/g；反應溫度選擇25、30、35、40、45 ℃。各因素進行5 次平行試驗，取平均值。

1.3.4 膠原蛋白提取工藝優化

根據單因素試驗結果，選擇對膠原蛋白得率影響較大的反應時間、反應溫度、酶用量作為試驗因素，以膠原蛋白得率作為考察指標，通過Box-Behnken 中心組合試驗，確定胃蛋白酶提取明太魚皮膠原蛋白的最佳工藝條件，響應面優化因素水平見表1。

表1 響應面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.3.5 膠原蛋白SDS-PAGE

將制備好的膠原蛋白溶解，配制成質量濃度為10 mg/mL 的膠原蛋白溶解液，以體積比3 ∶1 與緩沖液混合，沸水浴3 min，在120 V 的恒流下進行電泳，結束后轉移電泳膠到快速染色液中處理染色，隨后脫色，凝膠成像儀觀察成像。

1.3.6 傅里葉紅外光譜法分析明太魚膠原蛋白

稱取一定質量制備好的明太魚膠原蛋白，在傅里葉變換紅外光譜儀上掃描，波長范圍5 000～4 000 cm-1。

1.3.7 紫外光譜法分析明太魚膠原蛋白

稱取一定質量制備好的膠原蛋白，用0.5 mol/L 乙酸溶液作溶劑，配成濃度為0.5 mg/mL 的膠原蛋白溶液，另一個空白組只加入0.5 mol/L 乙酸溶液。檢測波長為190～400 nm，采集速率為0.5 nm/s。

1.3.8 明太魚膠原蛋白中氨基酸的組分與含量測定

采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定氨基酸的組分與含量。

1.3.8.1 色譜條件的確定

色譜柱：UG120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.1 mol/L 無水乙酸鈉∶乙腈=97 ∶3（體積比），混勻后用冰乙酸調節pH 值至6.5；流動相B：乙腈∶水=80 ∶20（體積比）；運行時間：0～45 min；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；樣品進樣量：20 μL；檢測波長：254 nm。流動相洗脫程序見表2。

表2 流動相洗脫程序Table 2 Mobile phase elution procedure

1.3.8.2 明太魚膠原蛋白樣品溶液的制備

準確稱取明太魚膠原蛋白樣品1.0 g，用25 mL超純水溶解定容，超聲30 min 后在3 000 r/min 下離心10 min，取上清液備用。

1.3.8.3 衍生化試劑的制備

向0.834 mL 三乙胺中加入5.166 mL 乙腈，混勻，制備1.0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液，備用。吸取0.072 mL的異硫氰酸苯酯，加入4.328 mL 乙腈，混勻，制備0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯-乙腈溶液，備用。

1.3.8.4 溶液的衍生化

吸取明太魚膠原蛋白溶液及氨基酸標準品混合溶液200 μL。先加入100 μL 的0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯-乙腈溶液，再加入100 μL 的1.0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液，混合均勻后靜置1 h。加入正已烷400 μL，混勻后靜置10 min。取下層溶液，用微孔濾膜過濾，待進樣。

1.3.8.5 氨基酸含量計算

將處理過的明太魚膠原蛋白樣品溶液進行衍生化，微孔濾膜過濾，過濾后進樣20 μL，得到樣品中各氨基酸峰面積圖譜，將峰面積積分值代入回歸方程，求得各氨基酸平均含量。

1.3.9 膠原蛋白抗氧化性測定

以維生素C（vitamin C，VC）、丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）為對照組，通過測定1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力及總還原能力探究其體外抗氧化作用。

1.3.9.1 膠原蛋白DPPH 自由基清除能力測定

取5 支比色管，加入3 mL 0.05 mmol/L 的DPPH溶液，再分別加入質量濃度為2、4、6、8、10 mg/mL 的膠原蛋白溶液3 mL，搖勻，靜置30 min，517 nm 測定吸光度，將3 mL 無水乙醇和3 mL 梯度質量濃度溶液混合均勻，于517 nm 測定吸光度，再將3 mL 無水乙醇和3 mL DPPH 溶液混合均勻，于517 nm 測定吸光度[11]。按公式（2）計算DPPH 自由基清除率。

式中：X2為DPPH 自由基清除率，%；A1為樣品與DPPH 反應后的吸光度；A2為樣品吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.9.2 膠原蛋白超氧陰離子自由基清除能力測定

膠原蛋白超氧陰離子自由基清除能力采用鄰苯三酚自氧化法進行測定[12]。按公式（3）計算超氧陰離子自由基清除率。

式中：X3為超氧陰離子自由基清除率，%；A1為空白組的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

1.3.9.3 膠原蛋白羥自由基清除能力測定

取1 mL 磷酸緩沖液（0.025 mol/L、pH7.4），1 mL 40 μg/mL 番紅花紅，0.5 mL 膠原蛋白溶液，1 mL 3%過氧化氫（新鮮配制），1 mL 0.945 mmol/L 乙二胺四乙酸鐵鈉（新鮮配制），混合后反應30 min 于37 ℃水浴處理，并測定520 nm 處吸光度。空白組使用0.5 mL 蒸餾水，對照組使用1.5 mL 蒸餾水，按公式（4）計算羥自由基清除率[13]。

式中：X4為羥自由基清除率，%；A1為樣品組的吸光度；A0為空白組的吸光度；A2為對照組的吸光度。

1.3.9.4 膠原蛋白還原能力測定

取一定濃度的樣品，加入2.5 mL pH6.6 的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和2.5 mL 體積分數1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50 ℃保溫20 min 后加入2.5 mL10%的三氯乙酸，混合后以3 000 r/min 離心10 min。取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL 和0.5 mL 質量分數為0.1%的FeCl3，在700 nm 波長處測定的吸光度表示樣品還原能力[14-15]。

1.4 數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示，采用Prism 9 和Design-Expert 軟件對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

酶用量、反應溫度、料液比、反應時間對膠原蛋白得率的影響見圖1。

圖1 各因素對膠原蛋白得率的影響Fig.1 Effect of each factor on collagen extraction rate

由圖1 可知，明太魚膠原蛋白得率隨酶用量增加呈先升高后降低的趨勢，在酶用量為1 500 U/g 時，膠原蛋白得率最佳，但隨著酶用量進一步增加，膠原蛋白得率下降，結果與甘文梅等[16]的研究結果一致，原因可能是過量的酶會抑制酶解作用，從而導致酶用量過高，得率下降。明太魚膠原蛋白得率隨反應溫度升高出現了先升高后下降的趨勢，在反應溫度為40 ℃時，膠原蛋白得率最佳。王錫念等[17]的研究表明酶法提取膠原蛋白最適溫度為35～45 ℃，與該試驗結果相同，原因可能是溫度過高，酶處于非最適溫度，酶活性受到抑制，導致得率下降。明太魚膠原蛋白得率隨溶劑體積增加出現了先增長后下降的趨勢，在料液比為1 ∶20（mg/L）時，膠原蛋白得率最佳，但隨著溶劑體積進一步增加，膠原蛋白得率逐漸下降，原因可能是溶劑體積過大會導致膠原蛋白分離困難。孫培利等[18]在提取牦牛蹄筋膠原蛋白中同樣發現溶劑體積過高會導致得率下降。明太魚膠原蛋白得率隨反應時間延長呈現先增長后下降的趨勢，反應時間為4 h 時，膠原蛋白得率最佳，但隨著反應時間延長膠原蛋白得率逐漸下降，可能原因是反應時間過長胃蛋白酶會部分水解，從而影響膠原蛋白提取，該結果與鄭平安等[19]的研究結果一致。因此，反應時間、酶用量、反應溫度分別選擇3～5 h、1 200～1 800 U/g、35～45 ℃進行后續響應面試驗。

2.2 響應面優化工藝

2.2.1 響應面試驗設計結果

根據單因素試驗結果，選取酶用量（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）3 個影響較顯著的因素為自變量，以膠原蛋白得率（Y）為響應因子，進行響應面試驗設計，試驗設計及結果見表3，回歸模型的方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 3 Design and values of Box-Behnken experiments

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model

對表3 中17 組試驗數據進行多元擬合回歸分析，得到酶用量（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）對膠原蛋白得率（Y）影響的多元二次回歸方程：Y=0.43+0.015A+5.754×10-3B-0.012C-0.032AB+0.040AC-4.71×10-3BC-0.066A2-0.012B2-0.052C2。回歸模型P＜0.01，差異極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，表示模型對試驗的擬合度較高。分析得到決定系數R2=0.952 1，說明響應值的變化有95.21%（＞90%） 來源于所選的3 個變量。說明該模型可很好地解釋95.21%的膠原蛋白得率的變化，各因素間線性相關好，試驗誤差小，可以采用該模型對不同條件下明太魚皮膠原蛋白的提取進行預測和分析。由表4 可知，各因素對膠原蛋白得率影響程度順序為A（酶用量）＞C（反應溫度）＞B（反應時間）。

2.2.2 響應面分析

各因素交互作用對響應值的影響見圖2。

圖2 各因素對膠原蛋白得率的響應面和等高線Fig.2 Response surface and contour plot of each factor on collagen extraction rate

由圖2 可知，AC 的響應面坡面較陡，說明酶用量和反應溫度的交互作用對膠原蛋白得率影響較大。經過軟件分析得到明太魚皮膠原蛋白的最優提取工藝條件為酶用量1 508.65 U/g、反應溫度41.11 ℃、反應時間3.89 h 時，理論膠原蛋白得率為49.98%。同時結合實際工藝操作，將參數優化為酶用量1 500 U/g、反應溫度為41 ℃、反應時間3.9 h，上述工藝參數做3 次平行試驗，此時實際膠原蛋白得率為48.90%，與理論值接近，驗證了該模型具有可行性與準確性，可以通過響應面優化試驗數據得出工藝參數。

2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳

膠原蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳結果見圖3。

圖3 明太魚膠原蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE profile of Theragra chalcogramma collagen

由圖3 可知，本試驗提取的膠原蛋白分子量在110～130 kDa 之間，經對比為α 鏈，與Ⅰ型膠原蛋白標準品表現一致。大多數的真骨魚類真皮的膠原蛋白含有其他脊椎動物所沒有的第3 條α 鏈，它是由3 條不同α鏈形成的單個α1（I）、α2（I）、α3（I）雜鏈。在同一條件下，α3 鏈和α1 鏈的化學性質相似，電泳遷移位置相同，因此從圖譜上不能推斷出是否含α3 鏈。亞基α1、α2 的分子量均在100 kDa 以上。

2.4 明太魚膠原蛋白傅里葉紅外光譜

明太魚膠原蛋白傅里葉紅外光譜圖見圖4。

圖4 明太魚膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy of Theragra chalcogramma collagen

由圖4 可知，本試驗提取得到的膠原蛋白含有酰胺的5 個主要膠原蛋白特征吸收峰A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。本試驗提取的膠原蛋白特征吸收峰波數與標準品對比差異甚小。在3 300 cm-1附近有吸收峰，說明兩種膠原蛋白中均存在氫鍵；分子中CH2基團的不對稱伸縮振動產生了酰胺B，說明本試驗提取的膠原蛋白的三級結構保留完整。C═O 伸縮振動造成酰胺I 譜帶的存在，其特征吸收頻率波數一般在1 690～1 625 cm-1，酰胺Ⅱ是由具有雙鍵性質的異相N—H 面內彎曲振動和C—N 伸縮振動共同產生的。酰胺Ⅲ是由C—N 伸縮和N—H 彎曲引起的，其頻率波數范圍為1 400～1 200 cm-1，與其他蛋白質的膠原紅外光譜不同，是Ⅰ型膠原蛋白特有的吸收。綜上，本試驗提取的膠原蛋白三螺旋結構保留完整。

2.5 明太魚膠原蛋白紫外吸收光譜分析

提取的明太魚膠原蛋白紫外吸收光譜圖見圖5。

圖5 膠原蛋白紫外吸收光譜圖Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of collagen

紫外吸收光譜是蛋白質分子各種紫外生色基團加入的結果，是判斷膠原蛋白類型的一個重要標志。其中I 型膠原蛋白在235 nm 附近會出現最大吸收峰，是膠原蛋白三螺旋結構的特征吸收峰。另外值得注意的是色氨酸含有苯環共輒雙鍵，在280 nm 的紫外吸收最強。由圖5 所示，本試驗制得的膠原蛋白在280 nm處沒有強吸收峰出現說明制備的膠原蛋白幾乎不含色氨酸或含量很低，同時本試驗制得的膠原蛋白在235 nm 附近有明顯的吸收峰，符合I 型膠原蛋白的紫外吸收。

2.6 明太魚膠原蛋白中氨基酸的組分與含量

明太魚膠原蛋白氨基酸的組分與含量見表5。

表5 明太魚膠原蛋白中各氨基酸的含量Table 5 Contents of amino acids in Theragra chalcogramma collagen

從表5 中可以看出，明太魚膠原蛋白中含有人體必需氨基酸在內的17 種氨基酸，但未檢測出色氨酸，其中含量較高的有甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸。綜上，經本試驗優化工藝提取的膠原蛋白氨基酸組分與含量豐富，可滿足人體健康需要。

2.7 體外抗氧化作用

2.7.1 DPPH 自由基清除能力

不同抗氧化劑對DPPH 自由基的清除能力見圖6。

圖6 膠原蛋白對DPPH 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of collagen to DPPH free radicals

由圖6 可知，DPPH 自由基清除率均隨抗氧化劑濃度的增加而增大。膠原蛋白與BHA 的IC50值分別為2.69 mg/mL 和6.82 mg/mL。因此可知膠原蛋白具有一定的DPPH 自由基清除能力。

2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力

不同抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除能力見圖7。

圖7 膠原蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of collagen to superoxide anion free radicals

在生物有機體代謝過程中，超氧陰離子是一種具有很強氧化能力的自由基，所以通過測定它們的清除效能來表示抗氧化劑的作用[20-21]。由圖7 可知，對超氧陰離子自由基的清除率隨抗氧化劑濃度的增加而增大。膠原蛋白和BHA 對于清除超氧陰離子自由基的IC50值分別為4.42 mg/mL 和8.13 mg/mL。濃度相同時，對超氧陰離子自由基清除能力順序為VC＞膠原蛋白＞BHA。因此可知膠原蛋白具有較好的超氧陰離子自由基清除能力。

2.7.3 羥自由基清除能力

圖8 為不同濃度VC、膠原蛋白和BHA 對羥自由基的清除能力。

圖8 膠原蛋白對羥自由基清除能力測定Fig.8 Scavenging ability of collagen to hydroxyl free radicals

羥自由基是在生物需氧代謝過程中產生的較強的氧自由基，所以通過測定羥自由基的清除能力，對抗氧化性的強弱進行分析[22-23]。由圖8 可知，隨抗氧化劑濃度的增加，羥自由基清除能力增大，濃度相同時，羥自由基清除能力順序為VC＞膠原蛋白＞BHA。其中膠原蛋白和BHA 對于清除羥自由基的IC50值分別為3.89 mg/mL 和5.32 mg/mL。而且當濃度相同時，明太魚膠原蛋白羥自由基的清除效果好于BHA，所以明太魚膠原蛋白是一種良好的羥自由基清除劑。

2.7.4 總還原能力

不同抗氧化劑對鐵離子的還原能力見圖9。

圖9 膠原蛋白的還原能力測定Fig.9 Reducing ability of collagen

在酸性條件下，抗氧化劑將Fe3+還原成Fe2+，以Fe2+的量或者相對于標準抗氧化劑的能力來表示抗氧化活性[24]。由圖9 可知，濃度相同時，樣品還原能力順序為VC＞膠原蛋白＞BHA。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上采用Box-Behnken中心組合設計方法設計響應面優化試驗，結合實際工藝最終得出明太魚皮膠原蛋白的最優提取工藝為酶用量1 500 U/g、反應溫度為41 ℃、反應時間3.9 h，優化后的工藝實際膠原蛋白得率為48.90%，接近理論值，驗證了該模型具有可行性與準確性。經SDS-PAGE鑒定本試驗提取的膠原蛋白分子量為110～130 kDa，傅里葉紅外光譜掃描結果可知本試驗制備出的膠原蛋白三螺旋結構保留完整，同時在紅外光譜中還含有酰胺的5 個主要膠原蛋白特征吸收峰A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ；利用紫外光譜技術分析可知本試驗所制備的膠原蛋白具有明顯符合Ⅰ型膠原蛋白的紫外吸收峰（235 nm附近），同時采用了RP-HPLC 法測定明太魚膠原蛋白中氨基酸的組成與含量，結果表明明太魚膠原蛋白中含有除色氨酸在外的17 種氨基酸，其中甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸含量豐富，表明經工藝優化后提取的膠原蛋白營養豐富，滿足人體健康需要。最后通過體外抗氧化試驗得出，明太魚膠原蛋白對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的半數抑制濃度（IC50）分別為2.69、3.89、4.42 mg/mL，相比于BHA 具有較強抗氧化作用。綜上，本研究高效提取了明太魚膠原蛋白，確定了最佳提取工藝，明確了其體外抗氧化作用，提高了明太魚副產品的附加價值，為副產物的綜合利用提供了思路。