復合磁性納米粒子用于食源性致病菌特異性檢測及滅活

郭寒瓊，吳浩天，齊暢，方遠*，王曉敏

（1.天津科技大學 食品科學與工程學院食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津中醫藥大學 中西醫結合學院，天津 301617）

食源性致病菌可以通過污染空氣、水和食物等方式與人類接觸，由其導致的感染會引起各種疾病，如惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等急性胃腸炎癥，重者可出現呼吸、循環、神經等系統并發癥[1]。因此，構建一個簡單有效的細菌即時檢測（point-of-care testing，POCT）和消除平臺具有重要意義。目前，大多數已開發的策略僅專注于對食源性致病菌的靈敏檢測而沒有后續的細菌滅活功能，或者僅專注于對病原菌的高效滅活而沒有早期預警功能，這些獨立的檢測和滅菌方法可能會造成細菌的二次傳播[2-5]。

抗生素作為治療細菌感染的傳統藥物在保護人類健康方面發揮著重要的作用[6-8]。然而，抗生素的過量和超范圍使用往往會導致耐藥細菌菌株的出現，給人類健康帶來了極大的風險[9-10]。近年來，基于高溫的光熱療法（photothermal therapy，PTT）因其系統毒性低、產生耐藥性的可能性較小而被認為是一種有前途的滅活細菌的新方法[11-13]。另一方面，基于比色法[14]、熒光[15]和電化學發光[16]的各種生物傳感器已經被構建用于細菌檢測。然而，比色法和熒光法通常需要外部光源或電源，不利于現場的快速檢測。相比之下，依賴于化學反應的化學發光（chemiluminescence，CL）可以不受激發光源的影響，能夠顯著提高信噪比，從而提高了檢測靈敏度[17-19]。

因此，本研究開發一種集化學發光檢測和光熱滅活于一體的食源性致病菌檢測及滅活平臺。以革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為研究對象，對實驗過程中H2O2濃度、實驗溫度以及孵育時間進行優化，從而獲得反應的最佳條件。在此條件下，基于Fe3O4@Van-S.aureus 復合物對魯米諾-過氧化氫（luminol-H2O2）化學發光體系的抑制作用對S.aureus 進行檢測。原理如圖1 所示。

圖1 Fe3O4@Van 檢測及殺菌原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of detection and sterilization of Fe3O4@Van

如圖1 所示，Fe3O4@Van 與S.aureus 細胞壁肽聚糖之間形成氫鍵，形成Fe3O4@Van-S.aureus 復合物，S.aureus 所分泌的過氧化氫酶可有效降低溶液體系中的化學發光強度，以化學發光強度作為輸出信號實現對致病菌的靈敏檢測。同時，因Fe3O4@Van 在近紅外區域具有寬廣的吸收，用808 nm 激光照射磁分離后的Fe3O4@Van 與細菌復合物產生大量熱能，從而實現對致病菌的殺死，可有效防止檢測完成后的二次污染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶、礦泉水：市售。FeCl3·6H2O、H2O2、聚乙二醇、醋酸鈉、N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[N-（3-dimethylaminopropyl）-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulphonic acid，MES）：國藥集團化學試劑有限公司；乙二醇：天津江天化工技術股份有限公司；牛血清蛋白、魯米諾、萬古霉素：上海阿拉丁試劑有限公司；金黃色葡萄球菌及其他種類的對照細菌：廣東省微生物菌種保藏中心；胰蛋白胨、瓊脂、酵母提取液：北京索萊寶科技有限公司；牛肉膏：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（BT25S）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；離心機（H1650-W）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；808 nm 激光器（220VAC）：海特光電有限責任公司；恒溫培養箱（DHP-2042 BS）：美國Thermo 有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2600）：日本SHIMADZU 公司；超微弱化學發光檢測儀（RFL-1）：西安瑞邁分析儀器有限公司；紅外熱成像儀（Fotric 225S）：美國FOTRIC 公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4NP s 和Fe3O4@Van 的制備

Fe3O4NPs 的制備參考文獻[20]的方法，稍作修改。將FeCl3·6H2O（1.35 g）溶解于含有乙二醇溶液（40 mL）的燒杯中，攪拌5 min。隨后將醋酸鈉（1.8 g）和聚乙二醇（0.5 g）加入燒杯中并在室溫下攪拌30 min。隨后將燒杯中的液體轉移到反應釜中，置于200 ℃的烘箱中加熱6 h。待液體冷卻后，使用超純水和乙醇分別洗滌3 次，獲得Fe3O4NPs。

將1 mL 的Fe3O4NPs（2 mg/mL）溶液用MES 緩沖液（pH5.5）洗滌3 次，加入EDC（4 mg）和NHS（4 mg）后于室溫下振蕩30 min，然后加入萬古霉素（1 mg）振蕩孵育12 h，最后通過MES 緩沖液（pH7.4）洗滌3 次，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 Fe3O4NPs 和Fe3O4@Van 的表征

將Fe3O4@Van 滴到硅片上，在室溫下進行干燥。將干燥后的硅片轉移至粘有導電膠的載物臺上，濺射鍍金，使用掃描電子顯微鏡觀察Fe3O4@Van 形貌。

將Fe3O4NPs 和Fe3O4@Van 溶液（350 μL）分別置于紫外分光光度計中，記錄其在200～900 nm 的吸收光譜。

利用Zeta 電位納米粒度分析儀記錄Fe3O4NPs、Fe3O4@Van 和萬古霉素的電位分布狀況。

1.3.3 Fe3O4@Van 的光熱性能分析

將Fe3O4@Van 置于48 孔板中，在距離孔板1 cm的位置利用808 nm 激發器添加一束功率密度為1 W/cm2的激光。利用紅外熱成像儀實時監測溶液溫度的變化，隨激光輻照時間延長，溶液溫度不斷上升并逐漸到達峰值。然后關閉激發器，記錄溶液的降溫數據。將Fe3O4@Van 溶液在808 nm 激光輻照/關閉各5 min，循環5 次，通過熱學成像儀每隔30 s 記錄溫度數據并繪制溫度循環曲線圖。

1.3.4 致病菌檢測原理驗證

將稀釋至不同濃度的S.aureus 菌液（1 mL）與Fe3O4@Van 孵育3 min，待細菌與Fe3O4@Van 充分結合后加入H2O2繼續孵育10 min。隨后吸取0.5 mL 上述混合溶液添加至含有魯米諾的化學發光體系中，利用超微弱化學發光檢測儀記錄對應化學發光強度。

1.3.5 條件優化

1.3.5.1 H2O2濃度優化

選取H2O2濃度為0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mmol/L，固定孵育時間為10 min、實驗溫度為25 ℃進行實驗。使用超微弱化學發光檢測儀記錄每組化學發光強度，以化學發光強度的比值為評價標準確定H2O2的最佳使用量，每組實驗重復3 次。

1.3.5.2 實驗溫度優化

在Fe3O4@Van-S.aureus 復合物中添加H2O2后，將上述混合溶液分別置于4、25、37、45、50 ℃下固定孵育時間為10 min。隨后使用超微弱化學發光檢測儀記錄每組化學發光強度，以化學發光強度的比值為評價標準確定最適宜的實驗溫度，每組實驗重復3 次。

1.3.5.3 孵育時間優化

將Fe3O4@Van 與S.aureus 振蕩孵育后，將上述Fe3O4@Van-S.aureus 復合物與H2O2分別孵育1、2、5、10、15 min。隨后使用超微弱化學發光檢測儀記錄每組化學發光強度，以化學發光強度的比值為評價標準確定最佳孵育時間，每組實驗重復3 次。

1.3.6 細菌的檢測

通過對實驗體系中H2O2濃度、實驗溫度以及孵育時間進行優化，確立反應的最優條件。固定H2O2濃度為0.8 mmol/L，實驗溫度為25 ℃，孵育時間為10 min。

在該反應條件下，Fe3O4@Van 分別與不同濃度（10、50、102、5 ×102、103、5 ×103、104、5 ×104、105CFU/mL）的S.aureus 孵育。將Fe3O4@Van-S.aureus 復合物與H2O2在室溫下孵育10 min 后，吸取上述混合溶液添加至化學發光體系中，利用超微弱化學發光檢測儀記錄對應化學發光強度。重復上述操作3 次，確定化學發光強度與細菌濃度的關系，實現對S.aureus 的定量檢測。

1.3.7 實際樣品的加標回收實驗

取5 mL 無菌牛奶于離心管中，離心10 min（8 000 r/min），離心后棄去上層的乳脂肪泡沫，此過程重復3 次。隨后將離心管中剩余液體混合均勻進行稀釋處理；礦泉水樣品預處理：取1 mL 市售礦泉水過膜，然后用超純水稀釋100 倍待使用。所有樣品均預先經高壓滅菌（121 ℃，20 min），再進行樣品加標實驗。

通過測量菌懸液在600 nm 處的吸光度確定菌液濃度。對培養至對數期的菌懸液進行梯度稀釋，使得待測樣液中所含細菌數量分別為1×103、1×104、1×105CFU/mL。隨后使用超微弱化學發光檢測儀記錄混合溶液的化學發光強度，將實際樣品中加標回收的檢測值與線性范圍內S.aureus 的理論值進行數據分析，最后根據公式計算樣品加標回收率，重復上述操作3 次。

1.3.8 光熱抗菌

利用涂布平板法來探究Fe3O4@Van 在808 nm 激光照射下的光熱抗菌能力，通過計算細菌菌落存活數量來評估Fe3O4@Van 對S.aureus 的破壞效果。實驗過程按以下4 組方式進行處理：1） 超純水處理的菌體不加激光照射；2）超純水處理的菌體加激光照射（808 nm，1.0 W/cm2）；3）經磁分離后Fe3O4@Van 偶聯的菌體加激光照射（808 nm，1.0 W/cm2）；4）經磁分離后Fe3O4@Van偶聯的菌體不加激光照射。以上4 組經過不同處理后，取適量菌懸液于固體營養瓊脂培養基上，用滅菌涂布棒進行涂布，隨后置于37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養12 h，通過平板菌落計數法計算4 種處理方式中Fe3O4@Van 的抗菌效率。

1.4 數據處理

定量數據以平均數±標準差表示，每組樣本不低于3 個。統計學比較采用方差分析和獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 表示統計學上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 材料表征

實驗材料合成后，使用掃描電子顯微鏡以及Zeta電位納米粒度分析儀來驗證Fe3O4@Van 的成功制備，結果見圖2。

圖2 驗證Fe3O4@Van 的成功制備Fig.2 Verification of Fe3O4@Van preparation

由圖2A 可知，Fe3O4@Van 在掃描電子顯微鏡圖像中顯示出了飽滿的球狀形態，經統計平均粒徑為499.8 nm。由圖2B 可知，Fe3O4NPs 和萬古霉素的表面分別攜帶負電和正電，由于Fe3O4NPs 與萬古霉素發生電位中和反應，Fe3O4@Van 表面的負電荷低于Fe3O4NPs。以上數據證實了Fe3O4@Van 的成功制備。

隨后使用紫外可見分光光度計分別對Fe3O4NPs和Fe3O4@Van 進行表征，驗證Fe3O4NPs 和Fe3O4@Van的光學性質，結果見圖3。

圖3 Fe3O4 NPs 和Fe3O4@Van 的紫外特征吸收光譜Fig.3 Characteristic UV absorption spectra of Fe3O4 NPs and Fe3O4@Van

Fe3O4NPs 和Fe3O4@Van 的紫外可見吸收光譜在400～900 nm 范圍內均顯示出了強烈的寬吸收，表明兩者均具有出色的光熱轉換潛力，可高效殺滅細菌。

2.2 實驗原理驗證

S.aureus 是一種常見的革蘭氏陽性菌，使用超微弱化學發光檢測儀對Fe3O4@Van 在檢測S.aureus 過程中的化學發光強度進行監測，對Fe3O4@Van 的檢測原理進行了驗證。細菌數量與化學發光強度的對應關系見圖4。

圖4 細菌數量與化學發光強度的對應關系Fig.4 Changes in chemiluminescence intensity with the number of bacteria

由圖4 可知，隨著實驗體系中細菌數量的增加，所分泌的過氧化氫酶逐漸增加，對含有H2O2和luminol化學發光體系的抑制作用就越強。

2.3 Fe3O4@Van 光熱性能研究

通過近紅外的激光（808 nm）照射研究Fe3O4@Van的光熱性能，結果見圖5。

圖5 Fe3O4@Van 溶液的光熱性能Fig.5 Photothermal properties of Fe3O4@Van solution

從圖5A 中可以看出，Fe3O4NPs 和Fe3O4@Van 的溫度隨著激光照射時間的延長而增加。所制備的Fe3O4@Van 可以抵抗長時間的激光照射，在5 個加熱/冷卻過程的循環后溶液的最高溫度并未發生明顯變化（圖5B），表明其具有優異的光熱穩定性。

2.4 條件優化

為了提高實驗體系的靈敏度，以金黃色葡萄球菌為代表，在其添加量為103CFU/mL 時對H2O2濃度、實驗溫度以及復合物與H2O2的孵育時間進行了優化。

2.4.1 H2O2濃度優化

由于細菌分泌的過氧化氫酶會分解溶液中的H2O2，外源加入H2O2的濃度會影響實驗體系的化學發光強度，因此對實驗中外源H2O2濃度進行優化，結果見圖6。

圖6 H2O2 濃度優化Fig.6 Optimization of H2O2 concentration

由圖6 可知，當H2O2濃度為0.8 mmol/L 時，檢測體系中化學發光強度的比值達到最大值，此時檢測效果最佳。因此，選用H2O2濃度為0.8 mmol/L 開展后續實驗。化學發光強度比值用1-（I/I0）來表示，其中I 表示在含有不同濃度H2O2的檢測體系中加入濃度為103CFU/mL 的金黃色葡萄球菌時，所對應的化學發光強度值；I0則表示在含有不同濃度H2O2的檢測體系中未添加細菌時所對應的化學發光強度值。

2.4.2 實驗溫度優化

由于實驗過程中涉及了活細菌和不同的材料，進一步考察實驗溫度對檢測過程的影響，結果見圖7。

圖7 實驗溫度優化Fig.7 Optimization of test temperature

從圖7 可以看出，在不同實驗溫度下溶液中的化學發光強度比值接近，說明實驗溫度對于細菌檢測的影響并不明顯。因此為了檢測過程的方便及快速，最終選擇接近于室溫的25 ℃作為檢測時的實驗溫度。化學發光強度比值用1-（I/I0）來表示，其中I 表示在不同溫度下，當檢測體系中含有濃度為103CFU/mL 的金黃色葡萄球菌時所對應的化學發光強度值；I0則表示在不同溫度下，當檢測體系中未添加細菌時所對應的化學發光強度值。

2.4.3 孵育時間優化

Fe3O4@Van 與細菌形成巨大的復合物后，復合物中的細菌仍會逐步分解H2O2，復合物與H2O2的孵育時間也會影響實驗的化學發光強度。孵育時間優化的結果見圖8。

圖8 孵育時間優化Fig.8 Optimization of incubation time

從圖8 可以看出，化學發光強度比值隨著孵育時間的延長，整體呈現上升趨勢。在10 min 時到達平臺期，為了保證最佳的檢測效果，同時節省實驗時間，因此本實驗選用的孵育時間為10 min。化學發光強度比值用1-（I/I0）來表示，其中I 表示在不同孵育時間下，當檢測體系中含有濃度為103CFU/mL 的金黃色葡萄球菌時所對應的化學發光強度值；I0則表示在不同孵育時間下，當檢測體系中未添加細菌時所對應的化學發光強度值。

綜上所述，選用H2O2濃度為0.8 mmol/L、實驗溫度為25 ℃和孵育時間為10 min 進行后續的細菌檢測和滅活實驗。

2.5 細菌檢測

不同濃度的細菌分泌的過氧化氫酶也有所差異，通過化學發光監測降解H2O2的速度可以間接計算細菌的數量。化學發光強度與S.aureus 數量的線性關系見圖9。

圖9 化學發光強度與S.aureus 數量的線性關系Fig.9 Linear relationship between chemiluminescence intensity and the number of S.aureus

將Fe3O4@Van 與不同濃度的S.aureus 孵育，隨后將Fe3O4@Van-S.aureus 的復合沉淀物分散在H2O2中。細菌所分泌的過氧化氫酶可分解體系中的H2O2，待反應完全后，吸取上述混合溶液加入化學發光體系中，利用超微弱化學發光檢測儀記錄對應化學發光強度。在一定范圍內，細菌數量越多，所產生的過氧化氫酶就越多，對化學發光體系的抑制作用就越強。因此，可以根據此變化建立化學發光強度與細菌濃度的變化關系。如圖9A 所示，S.aureus 濃度在10～105CFU/mL 之間與化學發光強度存在良好的線性關系，其R2=0.985 6。同時可使用智能手機記錄化學發光的變化情況，對應細菌數量下的化學發光強度變化（圖9B）。

隨后考察了該檢測方法對于不同菌種的特異性。細菌特異性檢測見圖10。

圖10 細菌特異性檢測Fig.10 Bacterial specificity

由圖10 可知，只有當S.aureus、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等革蘭氏陽性菌存在時才會使得化學發光強度明顯降低，而當大腸桿菌（E.coli）、耐卡那霉素大腸桿菌（KREC）以及沙門氏菌（Salmonella）等革蘭氏陰性菌存在時對化學發光強度的影響并不明顯。這是由于Fe3O4@Van 中所修飾的萬古霉素對革蘭氏陽性菌具有特異性識別能力，在實際檢測過程中可有效區分革蘭氏陰性與陽性細菌，實現對革蘭氏陽性細菌的特異性檢測。

2.6 實際樣品中的細菌檢測

為了進一步評估Fe3O4@Van 在實際樣品中檢測S.aureus 的準確性和可靠性，對牛奶以及礦泉水進行加標回收實驗，結果見表1。

表1 牛奶和礦泉水中S.aureus 的檢測Table 1 Detection of S.aureus in milk and mineral water

由表1 可知，Fe3O4@Van 對牛奶中S.aureus 的回收率為93%～103%，對礦泉水中S.aureus 的回收率為98%～103%。以上實驗數據表明本方法對檢測牛奶以及礦泉水等實際樣品中的S.aureus 具有較好的可行性。

2.7 光熱殺菌

為了檢驗Fe3O4@Van 的光熱殺菌效果，采用傳統的平板涂布法通過菌落計數的方式探究其對S.aureus 的抗菌能力。Fe3O4@Van 對S.aureus 的抗菌能力見圖11。

圖11 Fe3O4@Van 對S.aureus 的抗菌能力Fig.11 Inhibitory effect of Fe3O4@Van on S.aureus

由圖11A 可知，S.aureus 在有/無近紅外808 nm激光照射下，其菌落數量并無明顯差異，說明實驗條件溫和，激光照射本身并不影響S.aureus 的生物活性。在無近紅外808 nm 激光照射的情況下，經磁分離得到的S.aureus+Fe3O4@Van 復合物經培養后可以在營養瓊脂平板上觀察到大量的菌落，其菌落數量與空白組相差無幾，表明Fe3O4@Van 對S.aureus 的生長幾乎沒有抑制作用。但經過近紅外808 nm 激光照射后，S.aureus+Fe3O4@Van 組中的S.aureus 幾乎全部被殺死。由圖11B 可知，通過統計分析不同處理后的菌落數量，計算得出Fe3O4@Van 對S.aureus 的光熱抗菌效率為98.6%，表明具備優異光熱性能的Fe3O4@Van 可以實現對S.aureus 的滅活，可有效避免細菌的二次污染。

3 結論

本研究在Fe3O4NPs 的基礎上進一步修飾革蘭氏陽性菌特異性識別分子萬古霉素，形成Fe3O4@Van，從而增強Fe3O4@Van 與細菌的結合能力，通過優化H2O2濃度、實驗溫度以及孵育時間確定了以Fe3O4@Van 的化學發光強度為信號對S.aureus 檢測的最佳條件，研究結果顯示，Fe3O4@Van 對S.aureus 檢測的最優條件：H2O2濃度為0.8 mmol/L、實驗溫度為25 ℃以及孵育時間10 min。在該條件下，常見的食源性致病菌S.aureus在濃度10～105CFU/mL 之間與化學發光強度存在良好的線性關系。在對牛奶以及礦泉水的加標回收實驗中回收率為93%～103%，表明其在實際樣品中具有較好的應用性。同時，具備優異光熱性能的Fe3O4@Van 可實現對S.aureus 的原位殺死，抗菌效率高達98.6%。本平臺的成功構建為食品安全檢測與質量控制研究提供了新的策略。