基于高通量測序分析不同發酵方式下黃精泡菜中微生物多樣性

焦佳音，李嘉瑜，樊淑淼，王磊，鄭蕓霏，李明婉，李瑜，李連珍，洪利亞，4*

（1.河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450046；2.河南農業大學 林學院，河南 鄭州 450046；3.河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450046；4.北京大學 藥學院，北京 100191）

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科黃精屬多年生草本植物，口味甘甜，營養豐富，含有多糖、黃酮類、氨基酸和礦物質等成分[1-3]，具有抗氧化、抗衰老、降血糖及改善記憶力等功效[4-6]。黃精作為藥食同源的食材，市場上已開發出黃精茶[7]、黃精果酒[8]、黃精酸奶[9]、黃精餅干[10]等多種產品，市場占有率較高且深受消費者喜愛，黃精深加工及綜合利用已成為研究熱點。

泡菜是我國傳統發酵制品，富含多種纖維素、氨基酸和微量元素，能促進腸道蠕動、提高人體免疫力[11]。泡菜發酵是一個多菌種發酵過程，不同發酵方式菌群結構存在差別[12]。母水發酵是四川泡菜的特色工藝，在泡菜中加入母水可增強泡菜中微生物群落的穩定性并保持其原有風味[13]。接種發酵同樣常用于泡菜制作，采用人工接種特定發酵劑進行發酵，具有縮短泡菜發酵周期、減少雜菌污染和降低亞硝酸鹽含量等優勢[14]。目前已有將中藥材或者藥食同源材料制作泡菜的研究，如山藥[15]、黃芪[16]、桔梗[17]等，但關于黃精泡菜還鮮有報道，本研究采用母水發酵和接種發酵腌制黃精泡菜，通過感官評分、pH 值、總酸含量及亞硝酸鹽含量測定，并利用高通量測序技術分析兩種發酵方式中微生物多樣性的差異，以期為黃精泡菜產業化生產提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精：登封市土鑫種植專業合作社，經河南農業大學洪利亞博士鑒定為百合科黃精屬植物黃精；白酒：瀘州老窖股份有限公司；鹽：中鹽河南鹽業物流配送有限公司；泡菜發酵菌：廣東順德尚川生物科技有限公司；四川泡菜母水：江油蜀味山珍貿易有限公司；姜、花椒、小米辣、大蒜、冰糖：市售。

氫氧化鈉：上海麥克林生化有限公司；硫酸鋅、正辛醇、硝酸鉀、酚酞指示劑：國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇：上海泰坦科技有限公司；亞鐵氰化鉀、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、無水對氨基苯磺酸：天津市光復精細化工研究所；乙酸鋅：汕頭市西隴化工廠；TGuide S96 磁珠法土壤/糞便基因組DNA 提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；DNA 聚合酶：北京全式金生物技術有限公司；DNA 精確擴增試劑盒：美國Axygen 公司；DNA 文庫制備試劑盒：美國Illumina公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

250A 生化培養箱：寧波普朗特儀器有限公司；HH數顯恒溫水浴鍋：鄭州生元儀器有限公司；KQ-400DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；MR1029 破壁料理機：廣東新寶電器股份有限公司；721紫外可見分光光度計：上海康華生化儀器制造有限公司；PHS-3E 精密pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Synergy HTX 酶標儀：基因有限公司；OSE-MC8瞬時離心機：天根生化科技（北京）有限公司；Veriti96梯度基因擴增儀：美國應用生物系統公司；H1650-w醫用離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BE-1100 四維旋轉混勻儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

原料準備、初加工→瀝干水分→器具滅菌→調鹽濃度→接種→裝壇→白酒密封→25 ℃恒溫發酵→成品。

1.3.2 操作要點

選取無發霉腐爛、水分充足、根莖幼嫩的一年生黃精為原料，去除表皮和雜質，洗凈后切至1 cm×1 cm×1 cm 小塊，置于7%鹽水中充分浸泡去除麻舌感，清洗去除鹽味后瀝水備用。按黃精∶涼開水=1 ∶2 的質量比裝入泡菜壇，再添加3.0%鹽和4.0%冰糖攪拌均勻，按黃精質量0.1%添加菌粉或7.0%添加母水發酵液，并依次加入適量姜、大蒜、小米辣、花椒和白酒，密封后25 ℃恒溫發酵7 d。發酵至第1、3、5、7 天時進行采樣以測定相關指標，母水發酵樣品標記為M1、M3、M5、M7，接種發酵樣品標記為J1、J3、J5、J7。

1.3.3 評價與測定

1.3.3.1 感官評價

由食品專業人員20 名（男10 名，女10 名）組成感官評價小組對黃精泡菜進行感官評價，分別從色澤、香味、風味、質地進行評分，滿分100 分，感官評分標準見表1。

表1 感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.3.2 理化指標測定

總酸含量參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中酸堿指示劑滴定法進行測定；pH 值參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH 值的測定》中pH 計法進行測定；亞硝酸鹽含量參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺法進行測定，以亞硝酸鈉為標準品繪制標準曲線所得線性回歸方程為y=0.030 3x+0.002 1（R2=0.999 2），根據標準曲線計算樣品中亞硝酸鹽含量。

1.3.3.3 總DNA 提取和聚合酶鏈式反應擴增

總DNA 提取按照TGuide S96 磁珠法土壤/糞便DNA 提取試劑盒的說明書方法進行測定，使用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，引物引用：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。擴增體系（10 μL）：基因組DNA 5～50 ng，Vn F（10 μmol/L）0.3 μL，Vn R（10 μmol/L）0.3 μL，KOD FX Neo Buffer 5 μL，dNTP（2 mmol/L）2 μL，KOD FX Neo 0.2 μL，ddH2O 補充至10 μL；擴增參數：95 ℃5 min，95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃40 s，72 ℃7 min，4 ℃保持25～30 次循環。

1.3.3.4 測序數據處理與分析

微生物多樣性是基于Illumina Novaseq 測序平臺，利用雙末端測序的方法，構建小片段文庫進行測序。原始數據采用Trimmomatic v0.33 軟件進行過濾，Cutadapt 1.9.1 軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads。Usearch v10 軟件通過overlap對每個樣品的Clean Reads 進行拼接，然后根據不同區域的長度范圍對拼接后數據進行長度過濾。隨后使用UCHIME v4.2 軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。使用Usearch 軟件對Reads 在97.0%的相似度水平下進行聚類、獲得分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）；利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R 語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結構圖；使用QIIME2 軟件，對樣品Alpha 多樣性指數進行評估；使用QIIME 軟件進行Beta 多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 發酵方式對黃精泡菜pH 值的影響

pH 值作為指標參數有效表現出發酵環境和泡菜的成熟狀態[18]。發酵方式對黃精泡菜pH 值的影響見圖1。

圖1 發酵方式對黃精泡菜pH 值的影響Fig.1 Effects of fermentation methods on pH value of P.sibiricum pickles

由圖1 可知，發酵時間為1～3 d 時，兩種發酵方式下黃精泡菜pH 值均呈現快速下降的趨勢，第3 天pH值達到3.0，處于穩定狀態，表明兩種發酵方式黃精泡菜在第3 天開始成熟。

2.2 發酵方式對黃精泡菜總酸含量的影響

發酵方式對黃精泡菜總酸含量的影響見圖2。

圖2 發酵方式對黃精泡菜總酸含量的影響Fig.2 Effects of fermentation methods on total acid content of P.sibiricum pickles

由圖2 可知，黃精泡菜發酵過程中接種發酵總酸含量始終低于母水發酵，兩種發酵方式黃精泡菜初期總酸含量均較低，可能是發酵初期微生物處于適應期；發酵時間為1～3 d 時，兩種發酵方式黃精泡菜總酸含量增長較快，接種發酵第3 天總酸含量為7.3 g/kg，母水發酵總酸含量為11.9 g/kg；接種發酵3～7 d 時，總酸含量增長速度降低，第7 天總酸含量為10.8 g/kg；母水發酵3～7 d 時，總酸含量呈先上升后下降的趨勢，推測由于母水發酵在發酵后期有機酸和H+進一步積累，乳酸代謝途徑因乳酸的積累產生反饋抑制作用[19]。研究表明總酸含量在6.0～8.0 g/kg 時的口感較佳[20]，母水發酵1～3 d 達到最佳酸度范圍，而接種發酵3～5 d 才到達最佳酸度范圍。

2.3 發酵方式對黃精泡菜亞硝酸鹽含量的影響

發酵方式對黃精泡菜亞硝酸鹽含量的影響見圖3。

圖3 發酵方式對黃精泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.3 Effects of fermentation methods on nitrite in P.sibiricum pickles

泡菜發酵過程中硝酸鹽在硝酸還原酶作用下還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽達到一定量會致使食用人群細胞發生癌變[21-22]，GB 2762—2022《食品安全國家標準食品中污染物限量》規定中要求泡菜亞硝酸鹽含量不得高于20 mg/kg。由圖3 可知，兩種發酵方式黃精泡菜亞硝酸鹽含量不超過1.7 mg/kg，遠低于20 mg/kg 的標準限量，接種發酵亞硝酸鹽含量最高僅為0.5 mg/kg，滿足黃精泡菜食用安全。

2.4 發酵方式對黃精泡菜感官評分的影響

發酵方式對黃精泡菜感官評分的影響見圖4。

圖4 發酵方式對黃精泡菜感官評價的影響Fig.4 Effects of fermentation methods on sensory quality of P.sibiricum pickles

由圖4 可知，兩種發酵方式黃精泡菜感官評分隨發酵時間的延長呈現先上升后下降的趨勢。兩種發酵方式下黃精泡菜第1 天的成熟度偏低，導致香味和風味較弱；母水發酵第3 天時，感官評分最高，接種發酵第5 天時，感官評分最高，此時兩種發酵黃精泡菜氣味純正，質地脆嫩，形態完整，汁液清亮，整體口感最好；發酵第7 天兩種黃精泡菜質地變軟、口感偏酸且脆度降低。綜上所述，兩種發酵方式黃精泡菜口感良好，適用于工業化黃精泡菜生產。

2.5 高通量測序結果及分析

2.5.1 微生物Alpha 多樣性

不同發酵方式和發酵時間下黃精泡菜中微生物Alpha 多樣性見表2。

表2 Alpha 多樣性指數統計Table 2 Alpha diversity indexes

由表2 可知，利用高通量測序對兩種發酵方式黃精泡菜進行分析，共得到587 147 條序列。按照97.0%相似性對非重復序列進行分類操作單元聚類，得到OTUs 的代表系列，選出與OTUs 代表序列相似性在97.0%以上的序列，共劃分得到162 個OTUs 分類。兩種發酵方式黃精泡菜的測序覆蓋率均接近1，表明本次測序結果能代表樣品中微生物的真實情況；ACE 指數和Chao1指數相近，說明微生物群落豐富度相近。從Shannon 指數和Simpson 指數來看，母水發酵組數值均大于接種發酵組，說明母水發酵組樣品微生物多樣性較高；接種發酵第3 天Shannon 指數最大，第7 天最低；母水發酵Shannon 指數第1 天最高，第3 天最低，說明兩種發酵方式微生物群落結構復雜，發生持續性變化。

2.5.2 微生物群落結構動態變化分析

2.5.2.1 門水平生物群落結構分析

不同發酵方式和發酵時間下黃精泡菜中微生物在門水平上分布見圖5。

圖5 門水平物種分布Fig.5 Microbial distribution at the phylum level

由圖5 可知，不同發酵方式和發酵時間下黃精泡菜微生物群落共包含10 個門，其中厚壁菌門（Firmicutes，80.8%～98.6%）為絕對優勢菌門，其次優勢菌是變形菌門（Proteobacteria，0.8%～17.1%），Liang 等[23]研究發現泡菜中優勢菌門也是厚壁菌門和變形菌門，與本試驗結果一致。在接種發酵過程中，厚壁菌門相對豐度整體上呈上升趨勢，是接種發酵中的優勢門，第1 天相對豐度為86.4%，第7 天占比上升為91.1%；變形菌門相對豐度呈先升高后降低的趨勢，第3 天相對豐度最高，為17.1%，第7 天降低到7.9%，推測由于發酵初期乳酸積累量少，隨著發酵的進行乳酸積累，pH 值降低增加抑制變形菌門等雜菌的生長。在母水發酵中，厚壁菌門始終占比98.0%左右，主導整個發酵時期，而變形菌門等雜菌占比為1.0～2.0%。

2.5.2.2 屬水平生物群落結構分析

不同發酵方式和發酵時間下黃精泡菜中微生物在屬水平上分布見圖6。對黃精泡菜中微生物相對豐度較高的前10 個優勢屬進行分析。

圖6 屬水平物種分布Fig.6 Microbial distribution at the genus level

由圖6 可知，在接種發酵中，植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）是優勢屬，隨發酵的進行整體上呈上升趨勢，第1 天占比84.6%，第7 天上升至89.2%；拉恩氏菌屬（Rahnella1）、腸桿菌屬（Enterobacter）、沙雷氏菌（Serratia）等的占比逐漸下降，最終占比維持在1.0%～2.0%。接種發酵植物乳桿菌屬占比較多，其他屬占比不到20.0%，這可能與接種發酵使用的菌粉有關。在母水發酵中，隨著發酵進行植物乳桿菌屬占比減少，從第1 天占比50.1%下降至第7 天15.6%；遲緩乳桿菌屬（Lentilactobacillus）第1 天占比為26.6%，第5 天上升至54.6%，此后波動較小；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）隨著發酵進行占比上升，第7 天為15.1%，而嗜戊糖乳桿菌屬（Secundilactobacillus）占比略微降低，從第1 天10.5%下降至7.3%。母水發酵中植物乳桿菌屬、遲緩乳桿菌屬、乳酸桿菌屬、嗜戊糖乳桿菌屬等均屬于厚壁菌門中的乳桿菌屬，表明乳桿菌在泡菜發酵過程中起到主要作用[24]。相比較于接種發酵，母水發酵過程中微生物屬的種類占比變化較大，這是由于母水本身微生物組成比較復雜，隨發酵進行變化較大。

2.5.3 微生物群落差異性分析

不同發酵方式和發酵時間下黃精泡菜中微生物群落主成分分析（principal component analysis，PCA）結果見圖7。

圖7 PCA 分析圖Fig.7 Principal component analysis plot

由圖7 可知，第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為98.6%和0.6%。兩種發酵方式黃精泡菜微生物群落距離較遠，說明兩種黃精泡菜微生物群落結構差異較大。接種發酵4 個樣品離得比較近，說明隨發酵的進行微生物群落結構變化較小，而母水發酵4 個樣品分散度較高，說明隨發酵的進行微生物群落結構變化較大。

3 結論

本文探究黃精泡菜發酵過程中pH 值、總酸含量及亞硝酸鹽含量的變化，并利用高通量測序技術分析發酵方式不同導致的微生物多樣性差異。兩種黃精泡菜第3 天pH 值穩定在3.0，母水發酵總酸含量為11.9 g/kg，接種發酵總酸含量為7.3 g/kg，母水發酵第3 天和接種發酵第5 天成熟度最好，黃精泡菜酸脆爽口、形狀完整、汁液清亮。母水發酵亞硝酸鹽含量小于1.7 mg/kg，接種發酵亞硝酸鹽含量小于0.5 mg/kg，均遠低于20 mg/kg的標準限量。在微生物群落結構上，門水平上兩種發酵方式厚壁菌門構成主要類群，其次是變形菌門；屬水平上，接種發酵優勢屬是植物乳桿菌屬，而母水發酵是植物乳桿菌屬、遲緩乳桿菌屬、乳酸桿菌屬和嗜戊糖乳桿菌。Alpha 多樣性指數表明兩種發酵方式微生物群落豐富度相近，母水發酵微生物多樣性高于接種發酵；PCA 分析表明，兩種發酵方式黃精泡菜微生物群落結構差異較大，與母水發酵相比接種發酵群落結構變化較小。本研究豐富市場上泡菜種類的同時，為黃精藥食同源產品的開發利用提供參考。