低溫風干發酵羊腿中優勢乳酸菌的分離、篩選及鑒定

馬依努爾·米吉提，茹克葉木·阿不力米提，力俊琛，巴吐爾·阿不力克木

（新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

羊火腿是我國傳統的腌臘肉制品，羊后腿肉經腌制、風干、成熟而成，具有低脂肪、高蛋白的特點[1]。由于風干成熟期較長，羊火腿中的肌肉內源酶會影響肌肉蛋白和脂肪產生大量的小分子多肽、游離氨基酸、游離脂肪酸等易被人體消化吸收的物質，深受廣大消費者的喜愛。自然發酵肉制品中的優良菌株被寶貴自然菌種資源利用[2]。傳統發酵香腸主要用原料肉本身帶有的微生物經自然發酵而成，不僅不能保證發酵肉制品的穩定性和安全性，而且發酵時間也較長[3]。優良發酵劑在發酵肉制品加工中起重要作用，發酵菌種能縮短發酵肉制品的發酵時間及生產周期[4]。研究顯示，分離和篩選優良菌株作為發酵劑能保證產品品質，并能減少有害物質的形成[5]，已成為發酵劑的主要研究熱點。

近年來，對乳酸菌的研究集中于發酵泡菜、乳制品和發酵肉制品等食品領域[6]，其中發酵香腸在微生物的作用下，會發生一系列的化學反應，將食品原料轉化為具有獨特風味，并且保質期長的發酵肉制品[7]。另外，乳酸菌可以有效減少食品中亞硝酸鹽殘留量[8]，改善感官品質。李建等[9]從自然發酵香腸及泡菜水中分離出4 株優良乳酸菌。Papamanoli 等[10]對發酵香腸中的乳桿菌的抑菌效果進行研究，發現80 株乳酸菌均表現出對食品致病菌的有效抑制作用。沈清武[11]的研究結果表明，發酵劑與香腸質構特性有關聯，如戊糖乳桿菌能改善香腸的咀嚼性、硬度和黏聚性，還能提升發酵香腸的感官品質。

本研究旨在從低溫風干發酵羊腿中分離出適用于發酵香腸的優良乳酸菌菌株，并檢測其產接觸酶、產氨、產黏液等發酵特性，以及48 h 產酸能力和不同條件（溫度、NaCl、NaNO2）下的生長情況等加工特性，篩選出產酸快、發酵特性良好，保障香腸安全性的同時改善發酵香腸品質的優良乳酸菌菌株，以期為發酵香腸接種發酵提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗樣品

低溫風干發酵羊腿：新疆農業大學農產品加工實驗室制作保存；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：新疆農業大學動物醫學學院提供，菌種保存于新疆農業大學食品科學與藥學學院畜產品實驗室。

1.1.2 培養基與試劑

MRS 瓊脂培養基、MRS 肉湯培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；耐亞硝酸鹽培養基、耐鹽性培養基、氨基酸脫羧酶培養基、產黏液培養基、產H2S 培養基、精氨酸產氨培養基、葡萄糖產氣培養基、檢測過氧化氫酶培養基：參考凌代文等[12]的配制方法。

革蘭氏染色試劑盒、細菌基因組提取DNA 試劑盒、微量生化鑒定管、3%過氧化氫溶液、ddH2O，2×Taq PCR Green Mix、核酸染料、DNA Buffer：北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K（≥500 U/mg）、DNA 分子量標準Marker（100～2 000 bp）、溶菌酶（≥700 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；脫脂奶粉：紐瑞滋（上海）食品有限公司；氯化鈉、亞硝酸鈉、丙三醇（均為分析純）：天津市鑫鉑特化工有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD 超凈工作臺：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；DSX-30L-l 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；2720 thermal cycler 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；DYY-12 電泳儀：北京六一生物科技有限公司；LC-LX-HL210D 臺式離心機：湖南力辰儀器科技有限公司；DHP-9162 電熱恒溫培養箱、HH-4 水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；MSD106 顯微鏡：邁時迪（東莞）科技有限公司；UV1800 分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C pH 測定儀：上海大譜儀器有限公司；DW-40L92 超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；Fine-doX2 凝膠成像系統：上海天呈科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

在無菌條件下，將低溫風干發酵羊腿剪碎，稱取10 g 肉樣，轉移至90 mL 無菌生理鹽水中，振蕩均勻，并將稀釋度調為10-5g/mL，在MRS 瓊脂培養基中涂布均勻，于35 ℃厭氧環境中，培養24～48 h。挑選單菌落反復劃線分離[13]，直到獲得純菌株（鏡檢時全部菌落、菌體大小形狀均一致時判斷為已純化）。已純化的菌株采取革蘭氏染色、鏡檢后得到的陽性菌株進行斜面保藏并在最終濃度為50%的甘油中保存[14]。

1.3.2 菌株的初步篩選

將已純化的菌株接種于MRS 瓊脂培養基平板上，35 ℃培養48 h，選擇明顯溶鈣圈并革蘭氏染色為陽性、生長快的菌株[15]。

產黏性試驗：直接挑取平板上的單菌落進行觀察，篩選不產黏液的菌株[16]。

耐鹽、耐亞硝酸鹽試驗：將發酵特性優良的菌株接種于已添加6%、9%NaCl 及濃度150 mg/kg 亞硝酸鹽的液體培養基，35 ℃培養24 h 后用分光光度計測定600 nm 處的吸光值[17]。

過氧化氫酶試驗：將培養24 h 后的菌液添加到含有5%過氧化氫的玻片上，記錄結果并篩選陰性（不產氣泡）菌株[18]。

葡萄糖產氣試驗：葡萄糖產氣培養基的接種物于35 ℃培養24 h，篩選陰性菌株。如倒放小試管內有氣泡則為陽性，未出現氣泡則為陰性[19]。

氨基酸脫羧酶試驗：將培養物接種于添加賴氨酸、蘇氨酸等的培養基試管后，于35 ℃培養14～24 h，通過顏色特征判斷陰性、陽性[20]。

產H2S、精氨酸產氨試驗：參照東秀珠等[21]的方法進行。

1.3.3 菌株復篩試驗

1.3.3.1 生長曲線及產酸能力的測定

將待測菌株接種于肉湯培養基，30 ℃培養48 h，每4 h 測定OD600值及pH 值。

1.3.3.2 不同溫度下菌株生長能力將待測菌株接種于肉湯培養基，分別在10、20、30、35、45 ℃條件下培養24 h，測定OD600值。

1.3.3.3 耐鹽、耐亞硝酸鹽試驗

將待測菌株接種到含不同濃度（3%、6%、9%、12%、15%）的NaCl 及含有不同濃度（30、60、90、120、150 mg/kg）NaNO2的MRS 肉湯培養基，30 ℃培養24 h，測其OD600值。

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1 形態學特征

觀察菌落形狀，包括顏色、大小、透明度等，菌體形態采用革蘭氏染色鏡檢觀察[22]。

1.4.2 生理生化特征鑒定

將分離的菌株進行糖醇發酵試驗，檢驗菌株對各種糖醇類碳源的利用情況，并記錄結果。

1.4.3 16S rDNA 遺傳學鑒定

1.4.3.1 擴增引物

按照試劑盒說明書對細菌DNA 進行提取，以提取DNA 基因組為PCR 擴增模板，采用通用型引物[23][正向引物：（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 反向引物：（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）] 進行PCR擴增。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸10 min。將PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在美國國立生物技術信息中心（National Centerfor Biotechnology Information，NCBI） 基因庫中進行同源性分析。

1.4.3.2 擴增體系

上述制備的基因組DNA 作為PCR 擴增模板，采用25 μL 反應體系進行PCR 擴增，PCR 擴增體系組成及用量如表1 所示。

表1 PCR 擴增體系組成及用量Table 1 Composition of PCR system

1.5 數據處理

每個試驗做3 次平行，用Origin 8.0 軟件繪制數據圖，MEGA-X 軟件繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

通過稀釋分離平板法和劃線平板法，從低溫發酵風干羊腿中分離出43 株形態不同的疑似菌株，其中篩選出革蘭氏染色陽性桿菌、有明顯融鈣圈并接觸酶陰性菌31 株，初步判定為乳酸菌。乳酸菌主要發酵特性篩選結果見表2。

表2 乳酸菌主要發酵特性篩選結果Table 2 Screening results of lactic acid bacteria based on main fermentation characteristics

如表2 所示，所得的31 株菌均能耐受6%NaCl，其中25 株菌能夠在含9% NaCl 的MRS 肉湯培養基中生長；培養24 h 后31 株菌pH 值均從6.25 下降至5.1以下；23 株菌不產生H2S；29 株菌在MRS 瓊脂培養基中無黏液；所有菌株均能在濃度為150 mg/kg 的亞硝酸鹽培養基中生長；在葡萄糖產氣試驗中，有16 株菌不產氣；精氨酸產氨試驗中19 株菌不產氨；26 株菌在氨基酸脫羧酶試驗中結果呈陰性。篩選結果顯示，分離的31 株菌中6 株菌不能耐受9%NaCl，2 株菌產黏液，8 株菌產H2S，15 株菌葡萄糖產氣，19 株菌均無抑菌能力，12 株菌分解精氨酸產氨，5 株氨基酸脫羧酶陽性，均被淘汰。經過初篩，篩出5 株（GM09、GM23、GM28、PA15、KN02）發酵特性良好的優良乳酸菌，進一步篩選。

2.2 乳酸菌的生長曲線

乳酸菌的生長曲線如圖1 所示。

圖1 乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of lactic acid bacterial strains

由圖1 可知，篩選出的5 株菌均具有較強的生長能力。乳酸菌KN02、GM09 和GM28 在MRS 肉湯培養基的生長速度快于其余菌株，5 株菌在生長初期的0～8 h 內菌株的OD 值變化不明顯，因乳酸菌接種于新環境，需要適應培養的環境進而導致生長緩慢狀態，培養8 h 后細菌數上升趨勢明顯，菌體數量增加速度明顯加快，此時進入對數期。其中GM23、PA15 在24 h 后開始進入穩定期，GM09、GM28、KN02 在培養32 h 左右進入穩定期。

2.3 乳酸菌的產酸能力

乳酸菌在48 h 內pH 值的變化見圖2。

圖2 乳酸菌在48 h 內pH 值變化Fig.2 Changes in medium pH value of lactic acid bacteria within 48 h

由圖2 可知，5 株菌所處的培養基pH 值隨時間的延長均呈下降趨勢，培養48 h 時，GM09、GM23、GM28、PA15、KN02 所處培養基的pH 值分別為4.41、4.11、4.02、4.07、4.24。雖產酸速率存在差異，但5 株菌產酸能力均較強。結合生長曲線和產酸能力結果表明，5 株菌培養期迅速繁殖產生乳酸，進而降低pH 值，為發酵和菌株生長創造良好的條件。

2.4 不同溫度下乳酸菌的生長情況

不同溫度對乳酸菌生長的影響見圖3。

圖3 不同溫度對乳酸菌生長的影響Fig.3 Effects of different temperatures on the growth of lactic acid bacteria

由圖3 可知，溫度為10～35 ℃時，菌株的生長能力隨溫度的升高而增強。雖45 ℃時生長趨勢逆向發展，但在45 ℃條件下的生長情況基本良好；菌株在30 ℃和35 ℃條件下的生長能力明顯強于其他溫度條件，且相比于其他3 株菌，30 ℃和35 ℃時GM09 和KN02 的生長能力較強。

2.5 耐鹽性

不同NaCl 濃度對乳酸菌生長的影響見圖4。

圖4 不同NaCl 濃度對乳酸菌生長的影響Fig.4 Effects of different NaCl concentrations on the growth of lactic acid bacteria

由圖4 可知，隨著培養基中NaCl 濃度的增加，菌株的繁殖能力呈下降趨勢，且5 株菌的生長抑制程度不同。在NaCl 濃度為3%、6%時，5 株乳酸菌生長良好；當NaCl 添加量達到15%時，菌株生長能力最弱，NaCl 濃度為9%時，KN02、GM09 的生長性能較佳。此外，NaCl 濃度為15%時，KN02 的生長能力高于其他菌株，生長性能最佳。

2.6 耐亞硝酸鹽性

不同NaNO2濃度對乳酸菌生長的影響見圖5。

圖5 不同NaNO2 濃度對乳酸菌生長的影響Fig.5 Effects of different NaNO2 concentrations on the growth of lactic acid bacteria

由圖5 可知，隨著NaNO2濃度的增加，總體上菌株的繁殖能力呈下降趨勢，并且5 株菌的生長能力受到不同程度的影響。當NaNO2濃度為30、60 mg/kg 時，GM23生長能力比其余菌株強；當NaNO2濃度為150 mg/kg時，GM28 生長能力比其余菌株弱。此外，GM09 在不同亞硝酸鹽濃度下的生長能力相對較強。根據GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規定，亞硝酸鹽最大使用量為150 mg/kg。因此，在亞硝酸鹽鹽濃度150 mg/kg 的條件下，5 株菌均能生長，表明5 株菌可作發酵香腸的發酵劑。

2.7 菌株的分類學鑒定結果

2.7.1 菌株形態學鑒定結果

乳酸菌菌落形態特征見圖6。

圖6 乳酸菌菌落形態特征Fig.6 Colonies of lactic acid bacteria

由圖6 可知，乳酸菌在MRS 瓊脂培養基中，35 ℃培養24～48 h，菌落直徑大小有差異，KN02 和GM09 的菌落形態均呈白色圓形、不透明、形狀規則；PA15、GM23 及GM28 的菌落形態均呈乳白色，菌落表面光滑濕潤、不透明、邊緣整齊。

乳酸菌菌體形態學特征見圖7。

圖7 乳酸菌菌體形態學特征（×1 000）Fig.7 Cell morphology of lactic acid bacteria（×1 000）

由圖7 可知，GM09 和GM28 菌株在顯微鏡下觀察時，細胞呈短桿狀，KN02、PA15 及GM23 的菌株細胞均為桿狀，5 株菌均為革蘭氏陽性，其中GM09 和GM28 單個生長，KN02、PA15 及GM23 菌株呈不規則堆狀排列。

2.7.2 菌株生理生化鑒定結果

參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中乳桿菌屬鑒定所用的糖類，依據糖發酵試驗產酸時的變色情況以及菌株的表型特征，菌株鑒定結果如表3 所示。

表3 菌株鑒定結果Table 3 Results of strain identification

由表3 可知，初步鑒定菌株GM09 和PA15 為戊糖乳桿菌（Lactobacillus Pentosus），GM23、GM28、KN02為植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum）。

2.7.3 16S rDNA 序列同源性分析結果

2.7.3.1 PCR 產物的檢測與序列測定結果

菌株16S rDNA 擴增電泳圖見圖8。

圖8 菌株16S rDNA 擴增電泳圖Fig.8 Electrophoresis of 16S rDNA amplification of strains

如圖8 所示，菌株GM09、GM23、GM28、PA15 及KN02 擴增出的16S rDNA 片段大小均約為1 500 bp，條帶清晰且符合細菌16S rDNA 條帶長度，經測序得到長度分別為1 478、1 476、1 476、1 483、1 482 bp。

2.7.3.2 16S rDNA 同源性分析及系統發育樹

將菌株GM09、GM23、GM28、PA15、KN02 的16SrDNA序列與GenBank 中已知核酸序列進行Blast 分析，用MEGA-X 軟件分析并構建系統發育樹，結果如圖9、圖10 所示。

圖9 乳酸菌菌株GM09、PA15 的系統發育樹Fig.9 Neighbour-joining tree of GM09 and PA15

圖10 乳酸菌菌株GM23、GM28、KN02 的系統發育樹Fig.10 Neighbour-joining tree of GM23，GM28，and KN02

由圖9、圖10 可知，菌株GM09 與L.pentosus OK-325938.1 相似性高達100%，PA15 與L.pentosus ON-329060.1 相似性達96%，因此將菌株GM09、PA15 鑒定為戊糖乳桿菌；KN02 與Lactobacillus plantarum MT463669.1 相似性高達100%，GM23 與L.plantarum MH885507.1 相似性達99% ，GM28 與L.plantarum KM485577.1 相似性達94%，因此將菌株GM23、GM28及KN02 鑒定為植物乳桿菌。

3 討論

發酵肉制品中分離得到的菌種，由于原料、配方及生產條件的不同，也存在很大的差異。篩選菌種不僅能提高和保證產品質量，還能夠在性能及加工特性等方面超越自然發酵。

pH 值的下降使肉中蛋白質凝結，對產品色澤的形成有加快作用，使發酵肉制品在常溫下的保質期有所延長，還能保證發酵肉制品的穩定性[24]。Ammor 等[25]的研究表明，作為發酵劑的基本要求是乳酸菌在培養24 h 后，pH 值能降至5.2 以下。如果將有黏性的菌株添加到發酵肉制品中，會直接作用于產品形成濕潤、光澤感較好的外觀形態和緊致的內部組織結構[26]；為了防止肉質改變，選用過氧化氫陰性菌可以減少因氧化而導致的肉品質量改變，從而改善產品的色澤和風味。李珊珊等[27]的研究表明，發酵劑菌種產生H2S 和NH3等具有不良風味氣體是影響產品品質的另一重要因素。本試驗結果表明，31 株菌株在培養24 h 后，pH 值均從6.25 下降至5.1 以下，而在代謝過程中產生H2S的8 株菌、分解精氨酸產氨的12 株菌、氨基酸脫羧酶陽性的5 株菌、產黏液的2 株菌均不能作為肉品發酵劑。戴瑩等[28]的研究表明，氨基酸脫羧酶陰性乳酸菌作為肉類發酵劑培養物時，能有效減少香腸中生物胺的積累。如菌株具有氨基酸脫羧酶活性，會產生一些有害胺類物質，如組胺、腐胺和酪胺等。因此，本試驗中顯示氨基酸脫羧酶活性的5 株菌被淘汰。

選擇發酵肉制品發酵劑的重要因素是其具有耐鹽、耐亞硝酸鹽能力，且在較低鹽濃度情況下菌能夠生長。但隨著加工過程中水分的減少，鹽的濃度逐漸增加，但較高的鹽濃度導致菌株不能正常生長[29]。而對NaCl 耐受性較高的菌株則能夠在整個發酵和加工過程中具有較強的競爭力。一般選擇能耐受2%～10%鹽濃度的菌株作為發酵劑。而亞硝酸鹽添加量在國標中規定的最大添加量為150 mg/kg。結果表明，本試驗選取的5 株乳酸菌對鹽和亞硝酸鹽的耐受性都很好。

目前常應用的形態學和生理生化特征等分類鑒定方法仍存在耗時長、周期長、費用高、具有不確定性的缺點。為了保證鑒定結果的可靠性，將表型特征鑒定方法和16S rDNA 序列分析鑒定技術結合使用，使乳酸菌的分類鑒定結果更加準確。本研究中GM09、GM23、GM28、PA15 和KN02 的16S rDNA 同源性分析與表型特征鑒定結果一致。

4 結論

從低溫發酵風干羊腿中共分離出43 株菌，依據肉制品發酵劑的發酵特性，篩選出6 株菌不能耐受9%NaCl，2 株菌產黏液，8 株菌產H2S，15 株菌葡萄糖產氣，12 株菌分解精氨酸產氨，氨基酸脫羧酶陽性5 株，均被淘汰。通過菌株的產酸能力、生長曲線和耐高溫性等一系列指標，最終篩選出GM09、GM23、GM28、PA15 和KN02，5 株菌發酵特性好，具有較強的抑菌和產酸能力及良好的生長特性和耐受性。

經過形態學和生理生化特征并結合16S rDNA 序列分析，鑒定GM09、PA15 為戊糖乳桿菌，GM23、GM28、KN02 為植物乳桿菌，為進一步探討乳酸菌在發酵肉制品中的應用提供參考。