基于高通量測序技術的廣西咸梅細菌多樣性分析

熊英梅，向秀連，張苗苗，張彥，郭壯，王玉榮*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053；3.安琪紐特股份有限公司 酵母功能湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

青梅又被稱為梅子、果梅，主要產區是在我國長江流域以南，在浙江、廣東、廣西、云南和福建等地加工和食用較為廣泛[1]。青梅富含有機酸、無機鹽、維生素、礦物質等營養成分，能夠生津止渴、緩解疲勞，是開胃助消化的佳品[2]；有研究表明青梅既可以食用也可以入藥，在緩解發燒癥狀、調理腸道紊亂、治療腹瀉及皮膚疾病等方面亦有功效[3-4]。由于鮮青梅中含有大量酸性物質，食用起來酸澀，且保質期較短，故大部分青梅要在加工后進行儲藏、食用[5]。腌制作為一種常見的食品保藏方法，在我國有著悠久的歷史，廣西、廣東等地將其應用到了青梅加工過程中[6]。腌制好的青梅，當地稱為咸水梅、咸梅、酸梅、腌梅子等，其制作過程是將肉質較堅硬的新鮮青梅洗凈并晾干表面水分，入壇時分層放入適量的食鹽，置于陰涼通風的地方密封發酵60 d 即可食用[7]。王志江等[8]使用咸梅汁腌制新型乳酸菌飲料，發現咸梅汁能賦予產品天然的酸度和良好的咸梅風味；俞福惠[9]發現通過電滲析法可以將咸梅汁制成可食用的酸梅料；王輝等[10]從青梅自然發酵液中分離出一株拜氏酵母Y1，發現其具有良好生長特性且能賦予發酵液良好的香氣。然而，目前關于咸梅中微生物群落結構的研究較少。

本研究從廣西壯族自治區南寧地區采集9 份農戶自制咸梅樣品，采用第二代高通量測序技術對細菌群落結構進行解析，以期為分離咸梅中優勢發酵細菌并將其應用到飲料新產品研制中奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸梅樣品：市售，共9 份，編號分別為SM1～SM9，所有樣品均由南寧市農戶自制并于集市上銷售，采集時其腌制時間大約在50～60 d。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA 提取試劑盒：德國QIAGE 公司；16S rRNA V3～V4 區引物：上海桑尼生物科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）：翌圣生物科技（上海）股份有限公司；DNA Marker、10 倍緩沖液：青島蔚來生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Illumina MiSeq 高通量測序平臺：美國Illumina 公司；FluorChem HD2 化學發光凝膠成像系統：普諾森生物科技（上海）有限公司；ND-2000C 微量紫外分光光度計：美國Nano Drop 公司；TG16MW 微量高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；R930 機架式服務器：美國DELL 公司；S1000 梯度聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）核酸擴增儀：美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 咸梅樣品總DNA 提取與檢驗

稱取2.0 g 研磨碎的咸梅樣品，使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA 提取試劑盒提取9 份咸梅樣品的總DNA，通過0.8%的瓊脂糖凝膠回收后，使用微量紫外分光光度計檢驗并測定DNA 及其濃度，檢驗合格后的DNA 保存于-20 ℃中備用。

1.3.2 咸梅樣品中細菌16S rRNA PCR 擴增及高通量測序

以提取到的咸梅樣品總DNA 為模板，參照鮑偉等[11]的方法對咸梅樣品進行細菌16S rRNA V3～V4區PCR 擴增，引物為338F（5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'）和806R（5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'）。PCR 擴增產物通過1.0%的瓊脂糖凝膠回收后，將其濃度稀釋至100 nmol/L，使用MiSeq PE300高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 生物學信息分析

參照謝芳等[12]和石黎琳等[13]的方法對下機序列進行拼接和質控，將質控合格后的序列上傳至QIIME（V1.7.1）平臺進行細菌多樣性評價。將校準對齊的序列采用UCLUST 算法工具[14]分別以100%和97%的相似度劃分，進而創建分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）[15]，剔除含有嵌合體的代表性OTU 序列，在SILVA 數據庫[16]、核糖體數據庫[17]和Greengenes數據庫[18]中進行同源性比對，進而整理數據確定咸梅樣品中細菌分類學地位，然后對咸梅樣品中的Chao1指數和Shannon 指數等指標進行計算，最后對優勢細菌屬和核心OTU 進行相關性分析。本研究將咸梅樣品中相對含量大于1.0%的細菌門或屬定義為優勢細菌門或屬；將均存在于9 份咸梅樣品中且相對含量大于1.0%的OTU 定義為核心優勢OTU。

1.3.4 核苷酸序列上傳

本研究中9 份咸梅樣品原始序列數據均已上傳至MG-RAST 數據庫中，登錄號為mgp103141。

1.4 數據處理

使用R 軟件（V4.1.1）中的ggplot2 包對咸梅樣品中微生物的Chao1 指數和Shannon 指數進行可視化分析，使用Origin 2017 繪制咸梅樣品中優勢細菌門或屬的柱形堆積圖，使用R 軟件（V4.1.1）中的corrplot 和pheatmap 包繪制樣品中優勢細菌屬的相關性熱圖和核心OTU 熱圖。

2 結果與分析

2.1 細菌多樣性分析

9 份咸梅樣品根據100%相似度劃分序列共得到384 880 條高質量16S rRNA 序列，平均每份樣品42 764 條，根據97%相似度劃分OTU 共得到4 822 個OTU，平均每份樣品536 個。咸梅樣品Chao1 指數和Shannon 指數可視化分析結果見圖1。Chao1 指數在生態學中常用來估計物種總數，是評價物種豐富度的重要指標之一。Shannon 指數則是生態學中常用來定量描述一個區域的生物多樣性的重要指標之一，Shannon指數越大說明樣品中群落多樣性越高[19]。

圖1 咸梅樣品Chao1 指數和Shannon 指數的可視化分析Fig.1 Visual analysis of Chao1 index and Shannon index of salty plum samples

由圖1（a）可知，在測序深度為34 010 條序列時，比較Chao1 指數可得，樣品SM7 中細菌豐富度最大，其Chao1 指數為2 205；由圖1（b）比較Shannon 指數可得，細菌多樣性SM7＞SM2＞SM9＞SM1=SM3＞SM6＞SM8＞SM5＞SM4，由此可知，咸梅樣品中SM7 的細菌豐富度和多樣性均最高。由圖1 可知，不同咸梅樣品中細菌豐富度和多樣性存在一定的差異。因此，進一步在OTU 水平上對咸梅樣品中細菌多樣性進行分析。

2.2 基于OTU 水平細菌多樣性分析

基于9 份樣品中所含的OTU 總數繪制花瓣圖，對9 份樣品的細菌多樣性進行分析，可以直觀表達各樣品中含有的OTU 和共有的OTU，結果見圖2。

圖2 樣品中OTU 數量Fig.2 Number of OTU in the sample

由圖2 可知，樣品SM1～SM9 中分別含有1 288、1 459、1 406、1 288、976、1 278、1 981、1 169、1 524 個OTU，各包含了5 083、4 667、5 682、4 532、3 044、4 372、7 895、3 548、43 445 條序列，其中核心OTU 有104 個，僅占OTU 總數的0.84%，但核心OTU 包含的序列數占總序列數的97.55%，說明咸梅樣品中含有較豐富的細菌種類，且各樣品中特有細菌種類較多但含量少，而樣品中菌群組成是共有細菌菌群居多。此外，在咸梅樣品中均存在且相對含量大于1.0%的核心優勢OTU共有6 個，其累計平均相對含量為63.87%，對核心優勢OTU 進行聚類并進行相關性分析，結果見圖3。

圖3 咸梅樣品中相對含量大于1%的核心優勢OTU 熱圖Fig.3 Heat map of core dominant OTUs with relative content greater than 1% in salty plum samples

由圖3 可知，OTU6519 和OTU9265 被鑒定為伯克氏菌屬（Burkholderia），OTU10049 被鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus），OTU12397 被鑒定為毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae），OTU736 被鑒定為假單胞菌屬（Pelomonas），OTU10998 被鑒定為雷爾氏菌屬（Ralstonia），其平均相對含量分別為4.50%、1.37%、5.20%、2.55%、1.32%和48.93%。各核心優勢OTU 在咸梅樣品中的含量有較大差異，如OTU10049 在SM1 樣品中的相對含量為46.57%，而在其它樣品中的相對含量小于1.0%；而OTU10998 在SM1 樣品中的相對含量遠低于其它樣品，相對含量為3.57%，由此可見，咸梅樣品中核心優勢OTU 在樣品中的分布不均勻。由圖3 可知，被鑒定為雷爾氏菌屬的核心優勢OTU10998 在樣品SM2～SM9 中均存在且相對含量較其它核心優勢OTU 較高，可能是咸梅樣品中的主要菌屬。雷爾氏菌屬在溫帶、亞熱帶和熱帶地區分布廣泛，其可從植物受傷的根部、莖部或者未受傷的次生冠的根冠寄生于其體內，進而引發植物枯萎乃至死亡[20]。而廣西壯族自治區南寧地區地處亞熱帶地區，適宜雷爾氏菌屬的部分菌屬存活。雷爾氏菌屬中的大部分菌種可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，能影響人體中血紅蛋白運輸氧氣的能力，從而引起人體中毒甚至死亡，還有一些菌種屬于植物病原菌，可以引起青枯病[21-22]。由此可知，農戶制作的咸梅樣品存在一定的食用隱患，究其根本，可能與當地的氣候以及制作時操作環境和方法有關。

2.3 基于門和屬水平細菌群落結構分析

基于咸梅樣品細菌多樣性分析，進一步在數據庫中對質控合格的序列進行同源性比對，共鑒定出34 個門、110 個綱、170 個目、250 個科和501 個屬，其中僅有0.08%和6.90%的序列鑒定不到門和屬水平。本研究中相對含量大于1.0%的優勢細菌門共有4 個，其在各咸梅樣品中的平均相對含量見圖4。

圖4 咸梅樣品中優勢細菌門的平均相對含量Fig.4 Average relative content of dominant bacteria phylum in salty plum samples

由圖4 可知，咸梅樣品中4 個優勢細菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、硬壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其平均相對含量分別為66.97%、21.50%、5.30%和4.20%，前三者的累計平均相對含量高達93.77%，且為咸梅樣品共有的優勢細菌門。陳曉東等[23]以Illumina MiSeq 宏基因組測序技術對與咸梅樣品制作工藝相似的酸筍中的發酵液進行細菌群落結構分析，發現廣西地區的桂林、柳州、來賓、百色、南寧、貴港6 個傳統產地的酸筍發酵液中細菌主要來自4 個門類，分別為厚壁菌門（Firmicute）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），與本研究結果類似，此現象可能與采集的地區有關。由圖4 可知，樣品SM1 中變形菌門（Proteobacteria）的相對含量明顯低于其它樣品，而樣品SM4 中變形菌門（Proteobacteria）的相對含量亦明顯高于其它樣品，說明各樣品中優勢細菌門的種類和含量存在差異。

在屬水平上發現9 份咸梅樣品中相對含量大于1.0%的優勢細菌屬共有7 個，其在咸梅樣品中的平均相對含量見圖5。

圖5 咸梅樣品中優勢細菌屬的平均相對含量Fig.5 Average relative content of dominant bacteria genus in salty plum samples

由圖5 可知，廣西地區咸梅樣品中主要的菌屬是雷爾氏菌屬（Ralstonia），其在樣品SM2、SM3、SM4、SM5、SM6、SM8 和SM9 中占比較高，相對含量分別為59.30%、61.64%、73.48%、68.55%、65.32%、64.86% 和62.80%，而在樣品SM1 中占比較少，為4.08%；此外還有伯克氏菌屬（Burkholderia）、假單胞菌屬（Pelomonas）乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、諾卡氏菌屬（Nocardia）和另枝菌屬（Alistipes），在樣品中的平均相對含量分別為6.16%、1.35%、10.36%、1.75%、2.74%和1.00%。有研究人員發現雷爾氏菌屬的部分菌種對含鉀酸鹽礦物有較強的分解能力，在礦物生物風化上有一定的作用[24]；伯克氏菌屬在生物防治上有一定的作用，也有研究發現其可引起腹瀉。何夢雪等[25]對廣西南寧地區農戶自制的酸檸檬進行高通量測序，結果表明，雷爾氏菌屬（Ralstonia）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、假單胞菌屬（Pelomonas）和另枝菌屬（Alistipes）是優勢細菌屬，與本研究結果一致，這可能與當地原材料的生長環境有很大關聯。因此，在后續的咸梅研究中，應該進一步改善當地原料生長環境和加工環境，提高咸梅的食用安全性。對咸梅的研究亦可進一步篩選出優良的菌株，如伯克氏菌屬中的部分菌種具有固氮能力[26]，有利于植物生長；劉佳莉等[27]發現使用假單胞菌A-4 處理燕麥，有助于提高燕麥的鹽堿抗性。由此可知，咸梅中可能潛含有一些可應用于生物防治方面的菌種。

2.4 優勢細菌屬相關性分析

由細菌多樣性和菌群結構分析發現，咸梅樣品中含有豐富的細菌菌群，其中特有細菌種類較多但相對含量少，而共有細菌菌群居多，且樣品中主要以隸屬于變形菌門的雷爾氏菌屬為主。為進一步探究咸梅樣品中細菌菌屬間的關系，本研究對咸梅樣品中相對含量大于1.0%的優勢細菌屬進行了相關性分析，結果如圖6 所示。

圖6 相對含量大于1.0%的細菌屬相關性分析熱圖Fig.6 Heat map of bacterial genus correlation analysis with relative content greater than 1.0%

由圖6 可知，雷爾氏菌屬（Ralstonia）與伯克氏菌屬（Burkholderia）和假單胞菌屬（Pelomonas）均呈顯著正相關（P<0.05），芽孢桿菌屬（Bacillus）與另枝菌屬（Alistipes）存在顯著性正相關（P<0.05），伯克氏菌屬（Burkholderia）和假單胞菌屬（Pelomonas）也呈顯著正相關（P<0.05）。其中假單胞菌屬（Pelomonas）的細菌多數具有耐鹽性、分解脂肪和蛋白質的能力，所以在鹽腌食品中有生存優勢[28]；而芽孢桿菌屬（Bacillus）耐高溫、耐氧化并且穩定性好，其部分菌種是食品加工中重點預防的菌株[29]。由此可知，不同細菌類群之間可能存在一定的共生關系。此外，廣西咸梅樣品中部分優勢菌屬間亦存在拮抗或競爭關系，如乳桿菌屬（Lactobacillus）與雷爾氏菌屬（Ralstonia）和伯克氏菌屬（Burkholderia）均呈顯著負相關（P<0.05）。乳桿菌屬（Lactobacillus）可以產生乳酸和多種抗菌物質[30]，其在咸梅樣品中的平均相對含量為10.36%，可能是咸梅滋味形成的基礎；而雷爾氏菌屬（Ralstonia）和伯克氏菌屬（Burkholderia）的部分菌種是潛在的人類病原菌[31]，它們在咸梅樣品中的平均相對含量為59.44%，如果這些菌屬含量過高，會影響咸梅的食用安全性。因此，在后續對咸梅的研究中，可以采用傳統可培養技術收集優良的菌株，改善咸梅樣品的滋味品質，亦可發掘固氮能力強或鹽堿抗性強的潛在菌株。

3 結論

本研究以9 份廣西地區咸梅樣品作為研究對象，采用第二代高通量測序技術對其細菌多樣性和群落結構進行解析。通過細菌多樣性分析發現咸梅樣品中細菌種類豐富，特有細菌種類較多但含量少，菌群組成以共有細菌菌群居多。通過細菌群落結構解析發現變形菌門、硬壁菌門和放線菌門是廣西地區咸梅中共有的優勢細菌門，雷爾氏菌屬、伯克氏菌屬、假單胞菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、諾卡氏菌屬和另枝菌屬是廣西地區咸梅中的優勢細菌屬，其中雷爾氏菌屬（Ralstonia）與伯克氏菌屬（Burkholderia）和假單胞菌屬（Pelomonas） 均呈顯著正相關（P<0.05），芽孢桿菌屬（Bacillus）與另枝菌屬（Alistipes）存在顯著性正相關（P<0.05），伯克氏菌屬（Burkholderia）和假單胞菌屬（Pelomonas）也呈顯著正相關（P<0.05），還有部分優勢菌屬間存在拮抗或競爭關系。