基于二代測序技術探究葛根素治療酒精性肝炎的潛在分子靶點

張霞霞, 郎艷飛, 徐有青

1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院消化內科,北京 100070;2.北京大學第三醫院消化內科,北京 100191

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis,AH)導致約10%～20%患者肝硬化,而酒精性肝硬化是肝臟相關病例死亡的主要原因[1]。目前臨床上AH的有效治療手段欠缺,因此,積極尋找其有效治療AH的臨床藥物甚為急迫[2-3]。葛根素是從葛根中分離的天然異黃酮類衍生物活性物質,具有抗腫瘤和抗病毒的作用,可解諸毒,尤善解酒醒脾[4-6]。本課題組前期研究已論證葛根素對酒精性肝炎具有較好的治療作用,但具體作用機制及作用靶點尚未明確[7-8]。本研究基于分子二代測序技術探究葛根素治療AH的潛在分子靶點及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6雄性小鼠(維通利華公司);葛根素(山西西安瑞林生物科技有限公司);TRIzol試劑盒(Invitrogen公司,美國);反轉錄試劑盒(Takara公司,日本);分光光度計及Qubit3.0熒光定量儀(賽默飛世爾科學公司);全自動生化分析儀(Hitachi-7180);Illumina平臺(型號DR08502,武漢)。

1.2 實驗動物及處理

8周齡健康雄性C57BL/6小鼠9只,飼養于(23±2)℃、濕度40%～70%,12 h黑夜/白晝標準環境中,自由進食飲水。適應性喂養1周后,隨機均分為對照組、AH組、葛根素組。AH組及葛根素組予含5%Lieber-DeCarli酒精液體飼料飼養,第6周予乙醇灌胃1次(5 g/kg),葛根素組在酒精飼養同時,尾靜脈注射葛根素(4.2 mg/kg,1次/日),對照組予同等熱量液體飼料飼養。第8周末各組小鼠進行安樂死,留取血清及組織標本。

1.3 肝功能指標測定

待血液凝固后,離心5～10 min,3 000 r/min,取上層血清置于全自動生化分析儀設定位置上,進入“校準登記”后,測定谷丙轉氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)和谷草轉氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)。

1.4 RNA提取與質檢

研磨的肝組織標本加入1 mL TRIzol渦旋混勻;置于冰上數分鐘至溶液澄清,加200 μL氯仿,搖晃15 s,冰上放置2～3 min;離心后取上層轉移至EP管中,加入1倍體積異丙醇,混勻,-20 ℃放置30 min,離心后棄上清,加入1 mL 75%乙醇洗滌、離心,重復上一步驟,棄上清,小槍頭吸凈管中液體,室溫干燥2 min,加適量DEPC水溶解RNA,Nanodrop儀器對RNA濃度和純度進行測定,使用Qesp1000(RQN值)檢測RNA的完整性。

1.5 肝臟組織HE染色

將肝臟組織標本浸泡于福爾馬林中4～6 h,OCT包埋盒固定樣本,流水沖洗過夜10 h。將組織裝入包埋盒中,應用Leica ASP300S全自動脫水機脫水、透明和浸蠟,切片后進行HE染色,中性樹膠封片,于光學顯微鏡下觀察,采集圖像。其中肝臟組織學活動性采用Knodell組織活性指數(histological activity index,HAI)評估[9],總分22分,分數越高表示壞死越嚴重。

1.6 肝臟組織油紅O染色

取新鮮肝臟組織液氮速凍后,OCT包埋,6～8 μm切片,蒸餾水充分洗滌,油紅染色10～15 min,HE染核1～2 min,水洗,鹽酸酒精分化,返藍,水洗,甘油明膠封片,光學顯微鏡下觀察,采集圖像。脂肪變性評分參考文獻[10],總分4分,分值越高表示脂肪變性程度越高。

1.7 RNA-Seq測序及分析

取5 μg總RNA建庫,利用磁珠回收目的大小片段進行PCR擴增,質檢合格后上機測序。使用FastQC進行質量控制,具有≥90%覆蓋度的參考序列比對的讀數保留,通過質量過濾器(CLC Genomics Workbench v4.9)的序列使用。獲得高質量的測序數據,將數據比對到項目物種的參考基因組上,獲得全面轉錄本信息,采用Trimmomatic 0.36軟件獲取質控數據和edgeR 3.12.1軟件(http://bioconductor.org)識別組間差異表達基因,使用KOBAS 2.2.1軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn.)進行基因表達定量及GO、KEGG分析。

1.8 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料采用t檢驗,GO及KEGG富集條目P通過Fisher精確檢驗,相關性分析通過Pearson法進行計算。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠肝組織學形態及血清GPT、GOT變化

HE及油紅O染色結果顯示,對照組小鼠肝細胞形態完整、細胞核無增大、肝小葉形態完整;AH組小鼠彌漫性脂滴堆積和局灶性炎癥細胞浸潤;葛根素組肝組織炎癥較AH組改善,脂肪變性明顯減輕。葛根素組HAI評分較AH組明顯下降(P<0.05)。AH組較對照組GPT、GOT水平明顯升高(P<0.05),而葛根素組較AH組GPT、GOT水平則明顯下降(P<0.05;圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織學形態及血清學變化a為P<0.05,與AH組比較;b為P<0.05,與對照組比較;c為P<0.05,與葛根素組比較。

2.2 RNA提取及質檢結果

OD260/280、OD260/230均大于1.8,完整性檢測較好(RQN值均大于7.0),瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA文庫插入片段大小在400 bp左右(圖2A)。3例AH組和3例葛根素組分別獲得55 601 831個和52 934 410個矯正后短測序片段,主要分布在外顯子區,其次是內含子區及基因區間區(圖2B)。

圖2 RNA提取及質控結果A為瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫插入片段大小;B為各標本測序片段在參考基因組上不同區域的占比圖;C為AH組;T為葛根素組。

2.3 基因表達的層次聚類結果

采用RPKM值作為基因表達量的衡量指標消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響。基因表達的層次聚類結果如圖3所示,綠色、紅色分別代表通過基因表達水平獲得較低的樣品間相關性和較高的樣品間相關性。由同一節點產生的分支線段代表對應的樣品可以聚到一類,分支的長度代表樣本的相似度:長度越短,樣本間相似度越高;長度越長,樣本間相似度越低。

圖3 基因表達的層次聚類結果圖(C為AH組,T為葛根素組)

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路分析

AH組和葛根素組間有較多差異表達基因,上調178個,下調258個(圖4)。在差異表達基因中顯著富集的GO功能條目包括574個為生物過程,141個為分子功能,64個為細胞組分。涉及的GO富集量主要集中在脂質分解代謝過程的正向調節、細胞骨架的結構組成、微管等方面(圖5)。研究顯示兩組間差異表達基因被分為45條KEGG通路。兩組間上調和下調的差異表達基因前10條KEGG通路見圖6。

圖4 AH組及葛根素組間差異表達基因散點圖

圖5 差異表達基因中顯著富集的GO功能條目

圖6 KEGG通路結果

3 討 論

隨著經濟發展及生活方式的改變,酒精性肝病的發病率逐年上升;全球每年大約250萬人死于過量飲酒,是15～49歲年齡段壯年男性的主要致殘病因,造成巨大社會經濟負擔[11-12]。研究表明,除戒酒及肝移植外,糖皮質激素僅被認為對晚期酒精性肝硬化有效,但對長期生存率的改善度尚未可知,同時禁忌證較多限制了其臨床應用[13]。

葛根素在較多疾病中的抗炎作用已得到初步證實,如在結腸炎[14]及腎損傷中發揮保護作用[4],在酒精性肝損傷中可促進酒精代謝作用,也可通過調節肝細胞上皮-間充質轉化改善肝纖維化[8,15-17];但其抗酒精性肝損傷的機制研究甚少,治療作用靶點尚未明確。本研究對葛根素治療的AH小鼠進行基因轉錄組二代測序,探究其潛在作用靶點,為臨床用藥提供實驗依據[18]。

本研究顯示AH小鼠造模成功,同時葛根素治療組較AH組轉氨酶明顯下降,HAI評分及脂肪變性評分均明顯改善,提示葛根素對酒精性肝炎具有一定的保護作用。鑒于目前可獲取的臨床治療酒精性肝炎的藥物有限,葛根素可作為潛在治療酒精性肝炎的臨床用藥。本研究進一步通過二代測序技術探究葛根素治療酒精性肝炎的可能靶點,測序結果顯示,AH組、葛根素組分別平均獲得55 601 831個和52 934 410個矯正后短測序片段,測序片段主要分布在外顯子區,其次是內含子區及基因區間區。AH組和葛根素組間差異表達基因中,下調258個,上調178個。通過GO成功注釋,574個差異表達基因為生物過程,141個為分子功能,64個為細胞成分。特異性差異表達上調基因進行了詳細的GO項富集分析,主要涉及到有機酸代謝、細胞骨架的結構組成、雙鏈RNA結合、微管、髓鞘、外泌體等。兩組間上調和下調的差異表達基因進行了KEGG富集分析,主要富集在氨基酸代謝途徑以及縫隙鏈接、吞噬體、谷胱甘肽代謝、P53信號通路等,其中氨基酸代謝(酪氨酸代謝、精氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝)途徑可能是葛根素作用治療的潛在靶點,為后續進一步研究提供了有利證據。

綜上所述,葛根素對改善酒精性性肝炎具有一定療效,可能作為潛在的酒精性肝病的臨床治療用藥,本研究使用二代測序技術對葛根素治療酒精性肝炎小鼠的轉錄組進行全面分析,探究葛根素治療潛在靶點,為葛根素藥物在酒精性肝病治療方面提供理論基礎,為酒精性肝病提供新的臨床治療藥物。