抗炎因子A20與腫瘤患者預后及免疫調節通路的泛癌分析

尹翔安, 譚纖, 蔣斌元, 王丹玲

1.南華大學衡陽醫學院, 湖南衡陽 421001;2.南華大學未來科學研究院, 湖南長沙 410008;3.南華大學附屬長沙中心醫院, 湖南長沙 410004

炎癥和腫瘤之間存在密不可分的聯系,A20最初作為腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的反應分子被發現,也被稱作腫瘤壞死因子誘導蛋白3(tumor necrosis factor inducing protein 3,TNFAIP3),因其抗炎抗凋亡的生物學功能受到腫瘤研究者的廣泛關注[1-2]。作為炎癥信號轉導途徑中的重要調節因子,A20對核因子(nuclear factor,NF)-κB通路的激活有負向調控作用,可抑制核轉錄因子NF-κB信號通路中RELA p65的激活及入核,從而避免機體產生過度的炎癥反應[3]。

A20基因全長4 665個核苷酸,定位于6號染色體,編碼790個氨基酸的蛋白序列,相對分子質量約90 kDa。A20蛋白在氨基端存在卵巢腫瘤去泛素化酶結構域,具有去泛素化酶的功能;在羧基端存在7個鋅指蛋白序列,具有泛素化E3連接酶的作用,A20在泛素化過程中具有雙重作用,可對靶向分子進行雙向調節[4]。抗炎過程中,A20的主要作用是反饋抑制NF-κB信號通路的過度激活,避免炎癥反應的失控[5]。然而在腫瘤的發生發展過程中,慢性炎癥反應可能具有雙面性,既有抑癌的一面也有促癌的一面,研究發現,NF-κB信號通路的持續激活會促進腫瘤的存活,并引起腫瘤化療耐受等一系列后果[6-7]。NF-κB信號通路的持續激活會反饋誘導A20基因的過度表達,兩者之間的相互調節對炎癥反應的影響可能非常復雜,并給腫瘤患者預后帶來未知的結果。本研究借助生物信息學方法對不同腫瘤中A20基因的表達進行分析,發現高表達A20對部分腫瘤的預后存在不良影響,A20與腫瘤的免疫反應密切相關,且在大部分腫瘤中與NF-κB信號通路核心分子RELA p65共表達,提示A20是腫瘤免疫過程中非常重要的研究對象。

1 材料和方法

1.1 數據來源及表達分析

不同腫瘤及相應癌旁組織中A20基因的表達數據及隨訪資料均來自GTEx(https://gtexport.org/home/)和TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數據庫,整合GTEx和TCGA數據庫中樣本的表達數據后進行歸一化處理,使用log2表達倍數變化,P<0.05表示差異具有統計學意義。數據集中涉及的腫瘤名稱及相應的縮寫如下:腎上腺皮質癌(adrenocortical carcinoma,ACC)、膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA)、乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma,BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(cervical and endocervical cancers,CESC)、膽管癌(cholangiocarcinoma,CHOL)、結腸癌(colon adenocarcinoma,COAD)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBC)、食管癌(esophageal carcinoma,ESCA)、多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)、頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)、腎嫌色細胞癌(kidney chromophobe,KICH)、腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP)、急性髓細胞樣白血病(acute myeloid leukemia,AML)、腦低級別膠質瘤(lower-grade glioma,LGG)、肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)、間皮瘤(mesothelioma,MESO)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma,OV)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(pheochromocytoma and paraganglioma,PCPG)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma,PRAD)、直腸腺癌(rectum adenocarcinoma,READ)、肉瘤(sarcoma,SARC)、皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma,SKCM)、胃癌(stomach adenocarcinoma,STAD)、睪丸癌(testicular germ cell tumors,TGCT)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma,THCA)、胸腺癌(thymoma,THYM)、子宮內膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)、子宮肉瘤(uterine carcinosarcoma,UCS)、葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UVM)。

1.2 危險因素與患者預后分析

使用COX回歸分析A20基因表達對不同腫瘤的危險程度,繪制Kaplan-Meier生存曲線研究A20基因表達情況與患者生存期(overall survival time in days,OS)和無進展生存期(progression-free interval,PFI)的關系。危險因素(hazard ratio,HR)和95%可信區間使用單變量因素分析。

1.3 基因富集分析

根據A20基因的表達程度,將樣本平均分成高表達和低表達兩組檢測A20基因表達對腫瘤組織內生物學功能及信號通路的影響,使用GSEA軟件分析高表達組和低表達組中KEGG和HALLMARK通路的基因富集情況,FDR<0.05及NES>0.65被認為差異具有統計學意義。

1.4 A20與RELA p65基因的共表達分析

使用TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)對不同腫瘤組織中A20與NF-κB信號通路中RELA p65基因的表達數據進行分析,檢測A20基因與RELA p65的共表達情況。

1.5 統計學處理

使用t檢驗比較A20在癌組織與癌旁組織中的表達;生存分析中,采用COX回歸分析計算HR值和P值;采用Kaplan-Meier曲線比較不同A20表達情況的腫瘤患者預后情況。P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 22種腫瘤中A20基因的表達量發生明顯改變

比對27種不同腫瘤的癌組織與癌旁組織A20表達情況,只有BRCA、KICH、KIRP、PRAD、READ 5種腫瘤的癌與癌旁組織A20基因表達量差異無顯著性(P>0.05);存在A20表達差異的22種腫瘤中BLCA、LUAD、LUSC、OV、SKCM、THCA、UCEC、UCS這8種腫瘤的癌旁組織A20表達均高于癌組織(P<0.05);剩余14種腫瘤的癌組織中A20表達均高于癌旁組織(P<0.05;圖1)。

圖1 不同腫瘤中A20基因在癌與癌旁組織中的差異表達結果a為P<0.05;b為P<0.01;c為P<0.001,與相應癌旁組織比較。

2.2 A20基因表達與腫瘤患者整體生存期的關系

利用COX回歸分析發現,高表達A20基因是ACC、CESC、GBM、LGG這4種腫瘤患者OS的危險因素(圖2)。利用A20表達及患者OS數據繪制Kaplan-Meier曲線,結果顯示,在ACC、CESC、GBM、LGG腫瘤中A20基因高表達的腫瘤患者整體生存時間短于A20基因低表達的腫瘤患者(圖3)。

圖2 在ACC、CESC、GBM、LGG這4種腫瘤中A20基因高表達為腫瘤患者OS的危險因素

圖3 高表達A20基因表達與OS的Kaplan-Meier曲線

2.3 A20基因表達與腫瘤患者病情無發展間期的關系

利用COX回歸分析發現,高表達A20基因是ACC、GBM、THYM這3種腫瘤患者的危險因素(圖4)。利用A20基因表達及患者PFI數據繪制Kaplan-Meier曲線,發現在ACC、GBM、THYM這3種腫瘤中高表達A20基因的腫瘤患者PFI明顯少于低表達A20基因的腫瘤患者(圖5),提示A20基因表達高的腫瘤患者存在更大的腫瘤復發風險。

圖5 A20基因表達與PFI的Kaplan-Meier曲線

2.4 腫瘤中A20相關基因的功能富集分析結果

使用GSEA分析腫瘤基因信息數據中A20基因高表達組和A20基因低表達組中相關KEGG和Hallmark通路的基因富集情況,發現A20基因高表達與NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路的基因富集密切相關,并且TNF-α/NF-κB信號通路、IL-2/STAT5信號通路、炎癥反應相關的標志物基因發生富集。當A20基因處于低表達水平時,阿爾茨海默癥、核糖體功能、帕金森病及氧化磷酸化相關信號通路的基因發生富集,并且脂肪生成、胰臟B細胞功能、脂肪酸代謝及氧化磷酸化標志物相關基因發生富集(圖6)。

2.5 A20與RELA p65基因的共表達情況

鑒于A20與NF-κB信號通路的密切聯系,使用TIMER2.0平臺分析腫瘤數據庫多種腫瘤中A20與RELA p65的共表達情況,發現在大部分腫瘤中A20與NF-κB信號通路中的核心分子RELA p65表達存在顯著的正相關表達情況(圖7),僅在BRCA-HER2、GBM、SKCM及UVM數據中未存在兩者共表達的情況。

圖7 A20基因與RELA p65基因的共表達分析

3 討 論

本研究通過A20基因的泛癌分析發現其在大部分腫瘤中存在表達,且ACC、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LAML、LGG、LIHC、PAAD、STAD、TGCT這14種腫瘤中A20的表達顯著高于癌旁組織。高表達A20基因對于ACC、CESC、GBM、LGG這4類腫瘤患者的整體生存時間是高危因素,并且A20基因高表達可能會造成ACC、GBM、THYM這3類腫瘤患者更短的病情無發展期,提示更短的復發時間和更高的復發風險,但是部分腫瘤如ACC、CHOL、KICH、UCS的患者樣本數量未到100例,擴大數量可能會使預測結果更加可靠。基因富集分析發現A20與腫瘤患者的免疫反應密切相關,參與了多個免疫反應途徑,結合現有研究認為A20與NF-κB通路關系非常密切,且A20基因與RELA p65基因在30個腫瘤類別中呈現顯著的共表達關系;提示A20基因對NF-κB信號通路的調節非常重要,是研究腫瘤免疫的關鍵切入點。

A20基因的高表達對于GBM患者來說不僅影響整體生存時間還具有更高的復發風險,GBM患者基因表達數據顯示,在癌旁組織中A20的表達量明顯低于癌組織,但GBM癌組織中A20與RELA p65的表達未發現相關性,推測A20可能通過其他途徑被異常持續激活,且可能存在其他A20特異性識別的泛素化靶點,相關的分子機制亟待探索。有研究發現,在GBM中抑制A20基因的表達可降低膠質瘤細胞的生長速度,減少膠質瘤干細胞的生存時間[8-9],本文認為膠質瘤中A20的相關細節值得進一步研究和探索。在SKCM中,癌旁與癌組織的A20表達未發現顯著性表達差異,且A20與RELA p65不存在共表達關系,推測SKCM中存在某種特有的免疫反應調控機制,亦或者A20通過其他免疫調控通路參與了黑色素瘤的免疫調節,近年有研究者指出在黑色素瘤中A20可通過泛素化調控STAT3實現對PD-L1表達的影響,A20可能會是黑色素瘤免疫治療的一個新突破口[10]。

到目前為止,A20基因被發現已有30年,被認為是保持組織免疫平衡的重要分子,其抗炎、抗凋亡、抗壞死的功能也逐步被人們所認識,對A20的機制及應用的研究一直在繼續[11-12]。人們發現A20減少與帕金森疾病進展密切相關[13];而髓樣細胞A20的缺乏可導致小鼠脂肪酸代謝能力的增強,減少肥胖及胰島素抵抗的發生[14]。鑒于A20功能的重要性,以A20為基礎制定疾病治療策略將是未來的重要研究方向。隨著A20研究文獻的積累及生物信息學的進步,泛癌分析將更有效且快速的幫助研究者尋找解決問題的切入點,也希望本文能對A20的研究提供思路與線索。