小串鏈霉菌XG40全基因組測(cè)序及序列分析

賴(lài)寶春　戴瑞卿　曾天寶　陳淑妹　姚錦愛(ài)

關(guān)鍵詞：小串鏈霉菌；全因組測(cè)序；次級(jí)代謝合成基因簇；比較基因組分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

鏈霉菌屬是一類(lèi)好氧的革蘭氏陽(yáng)性放線(xiàn)菌，具有高度分枝的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，可代謝合成豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是最重要的抗生素產(chǎn)生菌，同時(shí)也是重要的促生及生防制劑，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛[1-4]。雖然鏈霉菌屬基因組具有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，但其基因組的GC含量較高（66%～74%），染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，往往會(huì)發(fā)生部分基因沉默的現(xiàn)象，新型活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)存在一定的難度[1， 5]。利用全基因組測(cè)序分析可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)鏈霉菌次級(jí)代謝基因簇的數(shù)量和類(lèi)型、編碼基因的大小、位置、功能和骨架結(jié)構(gòu)，以及代謝調(diào)控方式等，有助于新型代謝產(chǎn)物的快速挖掘[6-7]。當(dāng)前已有696 個(gè)鏈霉菌的基因組公布（http：//www.bacterio.net/streptomyces. html）。隨著測(cè)序技術(shù)的成熟，越來(lái)越多的鏈霉菌基因組被測(cè)序并應(yīng)用于生物防治研究。張博陽(yáng)等[1]對(duì)具有良好促生防病效果的桑氏鏈霉菌（Streptomyces.sampsonii）KJ40 進(jìn)行全基因組測(cè)序和分析，明確了其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑，預(yù)測(cè)到與促生防病相關(guān)的功能基因。王莎等[6]通過(guò)比較基因組學(xué)和泛基因組學(xué)對(duì)植物內(nèi)生鏈霉菌SAT1 的全基因組序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)出與SAT1 抑菌活性相關(guān)的2個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇。覃可等[8]通過(guò)解析生防鏈霉菌（Streptomyces sp.）FT05W 的全基因組序列，挖掘出與抗菌活性的7 個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，為煙草拮抗鏈霉菌分子生物防治研究奠定基礎(chǔ)。

小串鏈霉菌（S. catenulae）能夠產(chǎn)生氨基酸、抗生素FR-900130[9]、纖維抑制素[10-12]及（S）-乙炔甘氨酸[13]等多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗菌生物活性；還可以生物合成銀納米粒子，有很好的穩(wěn)定性、生物相容性、抗炎活性和抗菌活性[14]。小串鏈霉菌還能通過(guò)反硝化作用，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，催化ɑ-生育酚氧化為ɑ-生育醌，這是首次發(fā)現(xiàn)的生育酚微生物轉(zhuǎn)化[15]。研究還發(fā)現(xiàn)小串鏈霉菌對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)有致死作用，其提取液會(huì)導(dǎo)致大蠟螟的蛹期變長(zhǎng)，降低化蛹率和成蟲(chóng)羽化率，30 mg/1.5 mL 條件下大蠟螟幼蟲(chóng)的死亡率達(dá)86.7%，是潛在生物殺蟲(chóng)劑[16]。小串鏈霉菌能提高花生植株對(duì)重金屬的耐受能力，增加根系定殖率，提高固氮酶的活性，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量[17]。此外，小串鏈霉菌具有根際促生和生防作用，含有小串鏈霉菌制成的復(fù)合微生物菌肥不僅可用于防治小麥全蝕病，還可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)[18]。小串鏈霉菌XG40 是本研究室從草莓根際土壤中分離得到的拮抗菌，其抗菌譜廣，對(duì)蜜柚黑斑病菌、番茄葉霉病菌、香蕉枯萎病菌等14種植物病原菌均具有較好拮抗作用；對(duì)蜜柚果實(shí)黑斑病具有良好的防治效果，具有良好的開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景[19-20]。小串鏈霉菌能產(chǎn)生抗菌、抗蟲(chóng)、促生、抗重金屬等多種活性物質(zhì)，是生物防治方面利用價(jià)值較高的一種放線(xiàn)菌資源，目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用全基因組挖掘小串鏈霉菌生物活性物質(zhì)的相關(guān)研究報(bào)道。

為深入了解小串鏈霉菌XG40 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力和抑菌機(jī)制，本研究通過(guò)第三代PacBio全基因組測(cè)序分析，對(duì)小串鏈霉菌XG40 的基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和功能注釋、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析以及比較基因組學(xué)研究，為深入挖掘其生防潛力，開(kāi)發(fā)可用于農(nóng)業(yè)生物防治的次級(jí)代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 小串鏈霉菌XG40 由本研究室從草莓根際土壤樣品中分離、鑒定并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，硝酸鉀（KNO）1 g，氯化鈉（NaCl）0.5 g ， 硫酸鎂（ MgSO ） 0.5 g ， 磷酸氫二鉀（K2HPO）0.5 g，硫酸亞鐵（FeSO）0.01 g，瓊脂粉13 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.4，用于菌株活化培養(yǎng)；高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，硝酸鉀（KNO）1 g，氯化鈉（NaCl）0.5 g，硫酸鎂（MgSO）0.5 g，磷酸氫二鉀（K2HPO）0.5 g，硫酸亞鐵（FeSO）0.01 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.4，用于發(fā)酵液培養(yǎng)；馬鈴薯液體（PDB）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH 7.0，用于發(fā)酵液培養(yǎng)；馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.0，用于拮抗實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 儀器和試劑 可溶性淀粉、硝酸鉀、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、葡萄糖、Tris、EDTA、瓊脂粉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器設(shè)備包括智誠(chéng)ZWY-240 恒溫?fù)u床、上海盧湘儀TGL-20M 離心機(jī)、QIAGEN Genomic-tip DNA 提取試劑盒、BG-GDSAVTO520 凝膠成像系統(tǒng)、賽默飛世Thermo NANODROP2000 超微量分光光度計(jì)、Invitrogen QubitTM3Flurometer 熒光計(jì)、天能Tanon EPS600 電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與基因組DNA 提取 XG40菌株接種至高氏一號(hào)固體平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)6 d，轉(zhuǎn)接至搖瓶培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min 離心10 min，收集菌體，用于基因組DNA 提取。采用QIAGEN Genomic-tip DNA 提取試劑盒抽提基因組DNA，利用0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性，使用Nanodrop 和Qubit 測(cè)定DNA 的濃度和純度。

1.2.2 基因組的測(cè)序、組裝和注釋 本次測(cè)序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。將檢測(cè)合格的DNA 樣品進(jìn)行凝膠回收和DNA 文庫(kù)構(gòu)建。依次用Illumina noveseq-6000 和Pacbio 測(cè)序平臺(tái)完成二代和三代基因組測(cè)序。首先使用Hifiasm軟件進(jìn)行組裝，然后根據(jù)二代測(cè)序數(shù)據(jù)，采用Pilon v1.22 軟件對(duì)三代數(shù)測(cè)序據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)，再通過(guò)Circlator v1.5.5 軟件進(jìn)行環(huán)化和調(diào)整起始位點(diǎn)，最終得到準(zhǔn)確度更高的基因組序列。編碼基因采用Prodigal v2.6.3 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；rRNA 基因用Infernal v1.1.3 軟件預(yù)測(cè)；tRNA 用tRNAscan-SEv2.0 軟件預(yù)測(cè)；其他非編碼RNA（nc-RNA）用Infernal v1.1.3 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；CRISPR 用CRT v1.2軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；基因島用IslandPath-DIMOB v0.2軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；前噬菌體用PhiSpy v2.3 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；基因簇用antiSMASH v5.0.0 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；啟動(dòng)子用PromPredict v1 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；旁系同源基因用BLASTP v2.2.29 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)預(yù)測(cè)的基因組編碼蛋白序列信息，通過(guò)NR（非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)）、GO（基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)）、KEGG（京都基因和基因組百科全書(shū)）、eggNOG（直系同源基因簇的數(shù)據(jù)庫(kù)）、Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)、TrEMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因組進(jìn)行功能注釋。

1.2.3 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析 次級(jí)代謝產(chǎn)物的編碼基因通常在基因組中成簇存在，本研究采用antiSMASH 軟件對(duì)小串鏈霉菌XG40 菌株中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)可能合成的代謝產(chǎn)物。

1.2.4 比較基因組學(xué)分析 將小串鏈霉菌XG40的基因組序列與其他已經(jīng)測(cè)序完成的鏈霉菌基因組序列進(jìn)行比較分析，包括天藍(lán)色鏈霉菌（S.coelicolor）A3（2），吸水鏈霉菌菌（S. hygroscopicussubsp. hygroscopicus）OsiSh-2、NBRC 12859，陸源鏈霉菌（S. himastatinicus）ATCC 53653，伊朗鏈霉菌（S. iranensis）DSM 41954，黑孢鏈霉菌（S.melanosporofaciens）DSM 40318，雷帕鏈霉菌（S.rapamycinicus ） DSM 41530， 稀疏鏈霉菌（ S.sparsogenes ） DSM 40356 ， 根霉鏈霉菌（ S.rhizosphaericus）DSM 41760、0250，馬來(lái)西亞鏈霉菌（S. malaysiensis）F913、DSM 14702，利迪鏈霉菌（S. lydicus）ATCC 31975，白色鏈霉菌（S.albus）DSM 40763，紫黑鏈霉菌（S. violaceusniger）NRRL F-8817 和抗氧化鏈霉菌（S. antioxidans）MUSC 1641 等16 株菌株。16 株鏈霉菌的基因組序列及注釋信息下載自GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)。統(tǒng)計(jì)16株菌基因組的基本特征，采用Geneious 軟件中的Mauve 插件進(jìn)行基因組共線(xiàn)性分析，程序采用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小串鏈霉菌XG40全基因組概況

第三代全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，XG40 基因組由3 個(gè)contigs 組成，包含1 個(gè)染色體DNA 和2個(gè)質(zhì)粒DNA。完整的XG40 基因組序列全長(zhǎng)9 772 324 bp，GC 含量為70.58%，編碼8074 個(gè)基因，正鏈4171 個(gè)，負(fù)鏈3903 個(gè)，編碼基因占整個(gè)基因組的96.41%，平均長(zhǎng)度為1062 bp。進(jìn)一步的基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，XG40 基因組可能編碼18 個(gè)rRNA、77 個(gè)tRNA、153 個(gè)ncRNA、4個(gè)CRISPR、4 個(gè)基因島、1 個(gè)前噬菌體、46 個(gè)基因簇和2 個(gè)啟動(dòng)子。基因組圈圖見(jiàn)圖1。

2.2 小串鏈霉菌XG40全基因組注釋分析

利用eggNOG、GO、KEGG、Nr、Swiss-Prot、TrEMBL 和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)XG40 全基因組中8074 個(gè)基因進(jìn)行蛋白功能注釋?zhuān)谒袛?shù)據(jù)庫(kù)中共有7872 個(gè)功能基因被注釋?zhuān)急葹?7.50%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。進(jìn)一步對(duì)eggNOG、GO 和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的功能基因進(jìn)行分析，以獲取XG40中與拮抗物質(zhì)合成相關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成通路的基因信息。

2.2.1 eggNOG 注釋結(jié)果 將XG40 注釋基因的序列和eggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，完成同源基因注釋分類(lèi)，共有6033 個(gè)基因得到注釋?zhuān)▓D2），其中參與轉(zhuǎn)錄（transcription）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（amino acid transport and metabolism）、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（carbohydratetransport and metabolism） 、能量產(chǎn)生與傳遞（energy production and conversion）、次級(jí)代謝物生物合成（secondary metabolites biosynthesis）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（signal transduction mechanisms）以及復(fù)制、重組和修復(fù)（replication， recombinationand repair）的基因占較大比例，分別為9.76%、7.38%、6.61%、6.08%、4.97%、4.87%和4.78%。其他功能屬性的注釋基因數(shù)量比例相對(duì)較少。值得注意的是，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因達(dá)300個(gè)，如此多的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因極有可能是該菌株能夠產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的原因。

2.2.2 KEGG 注釋結(jié)果 XG40 全基因組的KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，總共有2679 個(gè)基因獲得功能注釋?zhuān)▓D3）。在這些功能注釋基因中，主要?dú)w屬于代謝（metabolism）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)（ABC transporters）。其中，與代謝相關(guān)的注釋基因數(shù)量最多，可能與XG40 拮抗物質(zhì)生成代謝通路相關(guān)。

2.3 小串鏈霉菌XG40 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測(cè)與分析

2.3.1 小串鏈霉菌XG40 次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇的預(yù)測(cè) 次級(jí)代謝產(chǎn)物是抗菌劑和其他生物活性化合物的重要來(lái)源，其編碼基因通常在基因組中成簇存在， 編碼具有多種功能的復(fù)合酶。軟件antiSMASH v5.0.0 是鑒定與分析基因組序列中生物合成基因簇（BGC）的最廣泛使用工具。基于特定于某些類(lèi)型的基因簇的基因的隱式隱馬爾可夫模型，antiSMASH 能夠準(zhǔn)確識(shí)別編碼所有已知廣泛化學(xué)類(lèi)別的次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因簇。本研究采用antiSMASH 軟件對(duì)小串鏈霉菌XG40 中所有的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行分析，共預(yù)測(cè)得到46 個(gè)可能的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇（表2），表明小串鏈霉菌XG40 菌株具有合成這些代謝產(chǎn)物的潛力和基因元件，但具體能否合成這些次級(jí)代謝產(chǎn)物還與其培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。放線(xiàn)菌的產(chǎn)生的抗蟲(chóng)劑、抗菌劑、抗癌劑等大部分功能性化合物由聚酮合成酶（PKS）和非核糖體肽合成酶（NRPS）2 種代謝途徑合成。小串鏈霉菌XG40 基因組中包含PKS 和NRPS 的基因簇共有24 個(gè)，占總基因簇?cái)?shù)量的52.17%，其中，T1PKS6 個(gè)，T2PKS 1 個(gè)，NRPS 6 個(gè)，NRPS-T1PKS 5個(gè)，T1PKS-NRPS-like 3 個(gè)，NRPS-T2PKS 1 個(gè)，NRPS-like 1 個(gè)，PKS-like 1 個(gè)。其他基因簇22個(gè)，其中鐵載體siderophore 3 個(gè)，萜烯terpene 6個(gè)，γ-丁內(nèi)酯butyrolactone 6 個(gè)，鑭肽lanthipeptide2 個(gè)，黑色素melanin 1 個(gè)，四氫嘧啶ectoine 1 個(gè)，β-萊克酮betalactone 1 個(gè)，芳基聚烯烴arylpolyene1 個(gè)，吲哚indole 1 個(gè)。

2.3.2 小串鏈霉菌XG40 的尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 基因簇分析 XG40 基因組編碼的46 個(gè)基因簇中，有7 個(gè)基因簇與已知基因簇（Cluster 1、Cluster 9、Cluster 14、Cluster 22、Cluster 25、Cluster38、Cluster 46）的相似性為100%；有4 個(gè)基因簇與已知基因簇（Cluster16、Cluster32、Cluster33、Cluster34）的相似性在80%以上，表明XG40 具有產(chǎn)生這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力。有29 個(gè)基因簇的相似性在1%～76%之間，說(shuō)明這些基因簇具有產(chǎn)生已知結(jié)構(gòu)代謝物或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的潛力。其余6 個(gè)基因簇沒(méi)有匹配到相似的基因簇，表明這些基因簇為未知基因簇，可能不具有產(chǎn)生新代謝物的潛能。

本研究發(fā)現(xiàn)，與已知基因簇相似較高的11 個(gè)基因簇中，尼日利亞菌素（nigericin）[21-22]、褐黃癌菌素V（gilvocarcin V）[23-24]具有抗菌活性。本研究中尼日利亞菌素和由褐黃癌菌素V 合成基因簇均是由PKS 代謝途徑合成。尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 的結(jié)構(gòu)如圖4 所示。利用antiSMASH 在線(xiàn)軟件對(duì)XG40 基因組的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行分析，從而確定XG40 中尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 基因簇相關(guān)信息（圖5）。Cluster 25 與紫黑鏈霉菌（S. violaceusniger）Tu 4113 的尼日利亞霉素合成基因簇（BGC0000114）的相似性達(dá)100%。將2 菌株中的尼日利亞菌素各個(gè)基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Cluster 25 中的基因與nigAI～XI、nigBI～BII、nigCI～CII 和nigD～E 等17個(gè)合成尼日利亞菌素的關(guān)鍵編碼基因的相似度為68%～93%（表3），說(shuō)明XG40 可能合成尼日利亞霉素。Cluster33 與灰黃鏈霉菌S. griseoflavus Tu4000 的褐黃癌菌素V 合成基因簇（BGC0001956）的相似性為88%；將2 菌株中的褐黃癌菌素V 各個(gè)基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Cluster 33 中的基因與gilA～K、gilOI～I(xiàn)V、gilM、gilP、gilQ、gilR、gilT、gilU、gilV、gilGT、gilMT 等24 個(gè)合成褐黃癌菌素V 的關(guān)鍵編碼基因的相似度為68%～93%（表4），說(shuō)明該基因簇可能負(fù)責(zé)合成褐黃癌菌素V。

2.4 比較基因組學(xué)分析

對(duì)XG40 基因組與16 株不同鏈霉菌參考菌株的基因組完成圖進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)XG40 與參考菌株基因組大小相近，GC 含量均高于70%，如表5 所示。其中，XG40 與陸源鏈霉菌ATCC53653、黑孢鏈霉菌DSM 40318、根霉鏈霉菌DSM41760、稀疏鏈霉菌DSM 40356 和馬來(lái)西亞鏈霉菌DSM14702 等4 株參考菌株在基因組大小、GC含量、基因編碼密度等方面非常相似，表明小串鏈霉菌XG40 具有鏈霉菌的典型特征。不同菌株在CDS 數(shù)目、rRNA 基因數(shù)目、假基因數(shù)目方面存在一些差異，表明菌株處在不同進(jìn)化階段，進(jìn)化過(guò)程中丟失或新獲得了一些不同的基因。

對(duì)16 株鏈霉菌的全基因組序列進(jìn)行ANI 分析，結(jié)果表明，XG40 與16 株鏈霉菌的ANI 值均在80%以上，與根霉鏈霉菌DSM 41760、馬來(lái)西亞鏈霉菌DSM 14702、黑孢鏈霉菌DSM 40318和陸源鏈霉菌ATCC 53653 的ANI 值較高，均在85%以上，分別為85.70%、85.58%、85.54%和85.06%。采用Geneious 軟件對(duì)XG40 和4 株ANI值較高的鏈霉菌進(jìn)行全基因組比對(duì)分析（圖6），5 株鏈霉菌基因組之間存在共線(xiàn)性，XG40 與根霉鏈霉菌DSM 41760 基因組之間有35 個(gè)局部共線(xiàn)區(qū)（locally collinear blocks， LCBs），與馬來(lái)西亞鏈霉菌DSM 14702、黑孢鏈霉菌DSM 40318 和陸源鏈霉菌ATCC 53653 基因組之間各有46、47、49 個(gè)局部共線(xiàn)區(qū)。XG40 與4 株菌的基因組之間存在較多的插入和缺失、倒位、易位等基因組重排事件，其中，XG40 相對(duì)于其他4 株菌的基因組存在3 個(gè)較大的DNA 片段（分別為0.9 Mb、0.85 Mb、0.5 Mb）插入和易位，分析發(fā)現(xiàn)，三原霉素、尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 等生物合成基因簇分別位于3 個(gè)DNA 片段上，因此推斷此插入和易位可能是因?yàn)閄G40 存在合成三原霉素、尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 的關(guān)鍵編碼基因，從而介導(dǎo)其生物合成。

3 討論

由于全基因組測(cè)序技術(shù)取得的長(zhǎng)足發(fā)展，測(cè)序時(shí)間大大縮短且測(cè)序成本不斷下降，研究者可以快速經(jīng)濟(jì)地完成微生物全基因組測(cè)序和生物學(xué)功能注釋[25-26]。本研究通過(guò)第三代PacBio 全基因組測(cè)序分析，結(jié)果表明，小串鏈霉菌XG40 基因組全長(zhǎng)9 772 324 bp，GC 含量為70.58%，編碼8074 個(gè)基因，與模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌（A3）2及其他拮抗鏈霉菌相近，表明小串鏈霉菌XG40具有鏈霉菌的典型特征。本研究對(duì)小串鏈霉菌XG40 進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，有助于從分子水平了解其生物學(xué)功能和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成潛力，為解析其高效的防病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

鏈霉菌能夠產(chǎn)生具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物和酶，在生物防治方面具有良好的應(yīng)用潛力。通過(guò)全基因組測(cè)序等高通量測(cè)序手段，解析鏈霉菌屬次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑已經(jīng)成為一種趨勢(shì)[1， 8]。本研究中小串鏈霉菌XG40 基因組中有8074 個(gè)基因，eggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù)中有6033 個(gè)蛋白序列得到注釋?zhuān)渲杏?00 個(gè)基因參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，占注釋到總基因的4.97%。通過(guò)antiSMASH 軟件預(yù)測(cè)到XG40 基因組有46 個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇。基因簇類(lèi)型有T1PKS、T2PKS、NRPS、NRPS-T1PKS、NRPS-T2PKS、鐵載體、萜烯、γ-丁內(nèi)酯、鑭肽、黑色素、四氫嘧啶、β-萊克酮、芳基聚烯烴和吲哚等。放線(xiàn)菌產(chǎn)生的抗蟲(chóng)劑、抗菌劑、抗癌劑等大部分功能性化合物由PKS 和NRPS 兩種代謝途徑合成[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)的具有抗菌活性的尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 合成基因簇均是由PKS 代謝途徑合成。通過(guò)比對(duì)尼日利亞菌素基因簇中各個(gè)基因片段發(fā)現(xiàn)，小串鏈霉菌XG40 的尼日利亞霉素基因簇的基因與紫黑鏈霉菌Tu 4113 中對(duì)應(yīng)的基因均具有較高的相似性，具有合成尼日利亞霉素的潛力。研究表明紫黑鏈霉菌（S. violaceusniger）YCED9 產(chǎn)生的尼日利亞菌素可以抑制腐霉菌、鐮孢菌和核盤(pán)菌等病原真菌的生長(zhǎng)[21]。吸水鏈霉菌（S.hygroscopicus）BRM10 產(chǎn)生的尼日利亞菌素可以抑制金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌等細(xì)菌的生長(zhǎng)[29]。此外，徐婷[30]利用生物信息學(xué)分析和LC/MS 研究表明吸水鏈霉菌（S. hygroscopicus）OsiSh-2 能產(chǎn)生尼日利亞菌素，其對(duì)稻瘟病菌有一定的抑制效果。通過(guò)比對(duì)褐黃癌菌素V 中各個(gè)基因片段發(fā)現(xiàn)，除gilS、gilN、gilL 基因外，小串鏈霉菌XG40 的褐黃癌菌素V 基因簇的其他基因與灰黃鏈霉菌Tu4000 中對(duì)應(yīng)的基因相似性均較高，具有一定的合成褐黃癌菌素V 能力。研究發(fā)現(xiàn)，褐黃癌菌素V對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、肺炎鏈球菌、糞鏈球菌及變形桿菌等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制活性[23-24]。小串鏈霉菌XG40 基因組中這些與抗菌相關(guān)活性物質(zhì)合成基因簇的發(fā)現(xiàn)，為小串鏈霉菌XG40 的生防作用機(jī)制提供了新的思路。該菌株具備一定的合成尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 等抗菌物質(zhì)的能力，后續(xù)將探討小串鏈霉菌XG40 中尼日利亞菌素和褐黃癌菌素V 等次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定以及生防機(jī)制研究。

為挖掘小串鏈霉菌XG40 與其他鏈霉菌的特性及共性，本研究對(duì)小串鏈霉菌XG40 和其他16株鏈霉菌進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，小串鏈霉菌XG40 基因組的基本特征與其他鏈霉菌屬菌株非常相似，符合鏈霉菌的基本特征。小串鏈霉菌XG40 與根霉鏈霉菌DSM 41760、馬來(lái)西亞鏈霉菌DSM 14702、黑孢鏈霉菌DSM 40318 和陸源鏈霉菌ATCC 53653 基因組進(jìn)行共線(xiàn)性比較分析發(fā)現(xiàn)，5 株鏈霉菌基因組之間存在局部共線(xiàn)區(qū)，同時(shí)存在較多的插入和缺失、倒位、易位等基因組重排事件，基因組之間具有保守性，又具有獨(dú)特性。本研究發(fā)現(xiàn)17 株鏈霉菌中特有基因數(shù)目較多，表明菌株處在不同進(jìn)化階段，進(jìn)化過(guò)程中丟失或新獲得了一些不同的基因，該屬在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中具有較高程度的水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。本研究為深入了解鏈霉菌次級(jí)代謝合成途徑提供了參考信息，為進(jìn)一步挖掘小串鏈霉菌XG40 的生防潛力提供有力依據(jù)。