適合全周期間作的橡膠樹品種熱墾628花藥再生體系研究

成鏡　黃天帶　戴雪梅　徐正偉

關鍵詞：橡膠樹；花藥；胚性愈傷組織；植株再生

中圖分類號：S794.1 文獻標識碼：A

橡膠樹體胚植株具有生長快、產量高等優點，其產量較同源老態芽接無性系增加了25.8%～66.3%[1-3]，生長快10%～20%[1]，是天然橡膠產業發展的新一代種植材料。中國熱帶農業科學院橡膠研究所（以下簡稱“中國熱科院橡膠所”）組培與轉基因課題組建立了以花藥為外植體的橡膠樹熱研7-33-97 品種的體胚發生再生技術體系，目前能夠實現規模化生產的橡膠樹品種僅熱研7-33-97，橡膠樹體胚植株品種覆蓋度不足限制了其應用面積。因此，為了提高橡膠樹體胚植株的推廣應用面積，亟待研發其他優良品種的體胚再生技術體系。

橡膠樹熱墾628 品種具有生長快、產量高、抗性強、冠幅小、宜植區域廣的優點，是中國熱科院橡膠所自主選育的農業農村部“十四五”主推品種。通過對海南、云南、廣東3 個區域試驗點適應性試種的熱墾628 的系統觀測，整體表現出了速生、產量高、抗逆性好的特性及良好的適應性，是具有較大推廣應用價值的膠木兼優品種[4]。膠園產值低是目前天然橡膠產業面臨的難題，在橡膠林下間作耐陰作物可提高膠園產值，由于熱墾628 樹型是單桿型，分支較少，是最適合林下間作的品種。常規膠園每667 m 種植33 株（株行距3 m×7 m），中國熱科院橡膠所進行示范種植的寬窄行（株距2 m，窄行距4 m，寬行距20 m）種植每667 m 種植28 株，使用體胚苗理論上可以增產20%，達到節本增效的效果。

為了成功地建立橡膠樹體胚發生再生技術體系，首先需要獲得較高質量的胚性愈傷組織，否則難以進行后續的體胚發生和植株再生過程。為了誘導出胚性愈傷組織，研究者們從基因型[5]外植體類型[6-7]植物生長調節劑[8]、蔗糖、鈣[9-10]、其他添加物[11]等方面進行研究，但效果不明顯。

本研究以橡膠樹雄花花蕾為材料，通過改變培養基中的植物生長調節劑、蔗糖、氨基酸、鈣含量、硝酸銀等研究其對胚性愈傷組織誘導的影響，以期在較短的時間內獲得胚性愈傷組織，為后續的體胚發生再生技術體系打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以種植于中國熱科院試驗場三隊的橡膠樹熱墾628 品種的花藥為材料，在春花期采集花蕾長度為2.5～3.0 mm、顯微鏡觀察花粉粒處于單核期且發育良好的雄花進行接種培養。

1.2 方法

1.2.1 花藥愈傷的誘導 摘取新鮮的雄花花蕾，75%的乙醇處理30 s，0.1%的HgCl 溶液浸泡10 min，浸泡期間不停晃動，使滅菌徹底，無菌水沖洗4～5 次，每次5 min。解剖針剝開花蕾，將花藥柱連同花藥接種于試管中，每管接種4 個花藥外植體。滅菌和接種均在超凈工作臺上進行。

1.2.2 正交試驗設計 將經過無菌消毒的橡膠樹雄蕊接種于含有MS 大量、MS 微量、MS 有機、肌醇0.1 g/L，0.4 mg/L 硫胺素，不同毒莠定、KT、6-BA、IAA 濃度的培養基中，并補充天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸、鹽酸鹽50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝膠2.2 g/L，毒莠定、KT、6-BA、IAA 濃度采用五因素四水平正交表進行設計（表1）；培養容器為帶透氣膜的玻璃試管，pH 5.8，在溫度為28 ℃的條件下培養30 d。采用五因素四水平L16（45）正交表設計，分別設置毒莠定濃度（因素A）、KT 濃度（因素B）、6-BA 濃度（因素C）、IAA 濃度（因素D）的五因素四水平正交試驗（表2）。每個處理組合40 個外植體，重復3 次，接種20 d 后統計愈傷誘導情況。

1.2.3 體細胞胚的誘導 將上述愈傷組織轉入體細胞胚誘導培養基中進行體細胞胚誘導以測試其是否為胚性愈傷，體胚發生為25 ℃暗培養。體胚發生培養基配方參照黃天帶等[12]的配方。每個處理重復3 次，每個處理2 皿，每個處理共20 個外植體，轉入體細胞胚誘導培養基后45 d，統計體胚誘導率。

1.2.4 植株再生測試 將上述獲得的正常體胚轉入植株再生培養基中進行植株再生，植株再生培養基參考華玉偉等[13]的配方及培養條件。

1.3 數據處理

實驗數據用Excel 2019 和SPSS 16.0 軟件進行處理和分析，用Duncan’s 法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 正交試驗設計結果分析

從表3 可以看出，不同培養基配方對愈傷誘導率的影響不同，其中處理8、12 愈傷誘導率最高，均達到100%；其次分別是處理9、10，愈傷誘導率均達93.3%；處理5 的愈傷誘導率最低，為63.3%。結果表明，處理8、9、10、12 與其余處理之間差異顯著，而處理1、2、3、4、6、7、14、16 之間無差異顯著。

從正交試驗結果的直觀分析（表4）可以看出，毒莠定濃度（因素A）對愈傷誘導率的影響較大，而KT 濃度（因素B）和6-BA 濃度（因素C）以及IAA 濃度（因素D）對其影響次之。從表4 的極值可確定4 個因素對愈傷誘導率影響程度順序為：A>B>C＞D；根據表4 中各因素水平均值的大小，可得愈傷組織誘導的最優組合為ABCD， 即毒莠定濃度20 mg/L 、KT 濃度2 mg/L、6-BA 濃度1 mg/L、IAA 濃度0 mg/L。

2.2 不同處理愈傷組織誘導情況

從圖1 可以看出，處理9、10、11、12 的愈傷組織表面有一些光滑且球形的愈傷組織，而其余處理中很少看見有這種類型的愈傷組織產生。

2.3 體細胞胚誘導結果分析

從表5 可以看出，處理1、2、3、4、5、6、7、8、13、15 均未誘導出體胚，體胚誘導率均為0。處理10 的體胚誘導率最高，顯著高于其余處理，體胚誘導率由高到低依次為處理10＞處理9＞處理11＞處理14＞處理12＞處理16，分別為33.3%、18.3%、16.7%、13.3、11.7%、6.7%。處理11、12、14 之間無顯著差異。

從圖2 可以看出，處理9、10、11 雖然能長出體胚，但是多為不正常的體胚，僅有處理14 能產生個別正常體胚。

2.4 植株再生情況分析

從體胚發生培養基中挑選出11 個較正常的體胚，轉入植株再生培養基中進行再生（圖3），其中出苗2 株，7 個只長根不抽芽，2 個既不抽芽也不長根，植株再生率為18%。

3 討論

在橡膠樹中，胚性愈傷組織的獲得主要有花藥培養和內珠被培養2 種途徑。其中，花藥培養是橡膠樹離體培養中研究最多的一個方向，也是橡膠樹生物技術育種的主要途徑[14]。經由花藥培養獲得的易碎胚性愈傷組織可通過繼代培養快速增殖，再進行批量的體胚誘導和植株再生[15]，或者進行懸浮培養建立胚性懸浮細胞系，以此作為原生質體培養的最佳分離材料[16]。因此，如何獲得良好的胚性愈傷組織對開展后續的研究具有重要的研究意義。

本研究明確了橡膠樹花藥愈傷組織誘導的最優組合為ABCD，即毒莠定濃度20 mg/L、KT濃度2 mg/L、6-BA 濃度1 mg/L、IAA 濃度0 mg/L。本研究結果表明，對胚性愈傷的誘導起主要作用的是毒莠定濃度，其濃度在20～30 mg/L 之間時，對胚性愈傷組織的誘導有促進作用。低濃度的毒莠定雖然也能誘導愈傷組織產生，但是這些愈傷組織幾乎為無胚胎發生能力的非胚性愈傷組織。

在體胚誘導階段所用培養基為橡膠樹熱研7-33-97 品種的體胚誘導培養基，產生的多為不正常的體細胞胚，可能是由于體胚發生的基因型依賴所致，今后的研究中也需要針對熱墾628 品種研發針對性的體胚誘導培養基。本研究所有處理在誘導愈傷組織25～28 d，愈傷組織達到快速增殖時期，為了更好地確定愈傷組織的生長發育狀態，今后要更加關注25 d 以前的愈傷組織狀態，在該研究的基礎上優化愈傷誘導培養基配方，使其能更快地從花藥誘導胚性愈傷，縮短胚性愈傷誘導時間，降低變異發生機率，以及為引進法國RITA培養系統提供更好的起始培養材料。本研究中植株再生率為18%，遠低于熱研7-33-97 的70%左右，原因可能有以下兩方面，一是所使用的體胚還不夠成熟，二是所使用的植株再生培養基不適用于橡膠樹熱墾628 品種植株再生。有1 株移栽于沙床中進行馴化。但由于移栽時工人不慎將葉片弄掉以及后期管理不到位，很遺憾最終沒能移栽成活。由于初次誘導的植株較少，且沒有移栽成活，所以未對其進行遺傳變異檢測，但是從植株的葉片形態和株高上看，無明顯變異特征。