羅漢松幼苗在不同磷環境下添加氮的生理響應權佳惠

招禮軍　朱栗瓊　邱廣龍

關鍵詞：羅漢松；幼苗；氮；磷；生理響應；光合作用；養分

中圖分類號：S791.46 文獻標識碼：A

羅漢松（Podocarpus macrophyllus）為羅漢松科（Podocarpaceae）常綠針葉喬木或者灌木。羅漢松枝、葉、種子、果實和根皮均具有藥用價值，對于心胃痛、血虛以及風濕和跌打損傷有較好的治療效果[1]，其種子提取物對胃癌細胞有明顯的抑制作用[2]。羅漢松樹形雅致且具有較強的吸附污染物能力[3]，常被用作庭院觀賞樹種和街道綠化樹種，而小型的盆栽羅漢松則是送友佳品，具有較高的經濟價值[4]，隨著近年來人們養生觀念的發展，羅漢松的藥用價值需求空前，原生環境羅漢松數量稀缺，人工繁育成為培育羅漢松的主流方式，并帶動了相關產業的發展[5]。高產、保質和節約成本是人工培育羅漢松的重要考慮因素，合理的氮磷施肥量有益于助力羅漢松在人工培育過程中實現價值最大化，促進產業經濟效益提高。

土壤環境中的氮磷元素是參與并影響植物光合作用和生理代謝的重要環境因子，對植物的生長發育至關重要，土壤環境中氮磷元素的添加能夠補充土壤養分，解除或減緩植物的生長限制[6]。亞熱帶地區土壤酸化度高[7]，雖土壤環境中磷含量豐富，但大多數易與金屬元素結合固定在土壤中，植物可利用的有效磷含量低[8]，磷素缺乏會限制植物光合速率，使ATP 合成受阻，植物生長發育緩慢。我國南方面臨嚴重的氮沉降問題，大氣中的氮素通過干沉降直接進入植物氣孔參與植物生長代謝或沉降到地表土壤中[9]，氮素是植物葉綠體內相關酶合成的重要元素[10]，氮肥過低植物葉綠素合成減緩，植物光合效率受限，植物生理反應過程中相關酶活性減弱，植物代謝緩慢；氮肥濃度過高則對植物產生脅迫[7]。此外，人工林場在羅漢松種植過程中存在肥料施加隨意，過度施肥等問題[11]，羅漢松生產力和人工培育成活率受限，經濟效益大打折扣。羅漢松生長年限較長，生長緩慢，基于土壤環境磷限制和大氣氮沉降現狀，探究不同土壤磷環境下，土壤氮素含量增加時羅漢松幼苗生理活性、葉綠素含量、光合特征和葉片養分含量的響應機制，對人工大規模種植羅漢松時科學施肥提供理論依據、保護土壤可持續發展、提高羅漢松人工種植林地生產力和土地資源的有效性具有重要意義。因此，本研究以盆栽法培育的羅漢松幼苗為研究對象，設置低磷、高磷和低、中、高3 個氮濃度的試驗，以期對羅漢松的人工種植、室內培育和土壤資源的有效利用等方面起到科學的指導作用。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

研究地點位于廣西壯族自治區南寧市廣西大學林學院校內教學基地苗圃溫室大棚內，地理位置為22°50′N，108°17′E，大棚全年為南亞熱帶季風氣候， 日照充足， 雨水充沛， 年均氣溫為21.6 ℃，夏季最熱平均氣溫為28.2 ℃，冬季最冷平均氣溫為12.8 ℃，相對濕度為79%[12]。

1.2 實驗材料

2019 年9 月中旬在廣西壯族自治區南寧市隆安縣金穗園林花木場購買平均株高為（49.9±0.78）cm、平均基徑為（6.90±0.11）mm 無病蟲害的2年生羅漢松幼苗作為實驗材料。2019 年9 月末，將羅漢松幼苗根系泥土用清水沖洗干凈，移植到長寬高為31.5 cm×31.5 cm×22.5 cm的塑料花盆中（帶底座），每盆裝紅壤土∶沙土=1∶1 混合土壤15 kg，每盆1 株，試驗幼苗培養于大棚內，緩苗2 個月后進行施肥處理。施肥實驗前測得種植羅漢松幼苗土壤背景值如下：pH 為7.32±0.33，全氮（TN）為（0.99±0.06）g/kg，全磷（TP）為（0.28±0.08）g/kg，全鉀（TK）為（11.29±1.15）g/kg，水解性氮為（111.09±8.13）mg/kg ， 速效鉀為（50.13±3.82）mg/kg，有機磷為（5.62±0.81）mg/kg。

1.3 實驗設計

采用2×3 雙因素正交實驗設計（表1，2 種磷濃度，3 個氮濃度），每個處理3 個重復，每個重復5 盆，每盆種植1 株，共90 盆。供試肥料氮肥為尿素（含N 46.5%），磷肥為過磷酸鈣（含PO 12.0%）。具體濃度及編號見表1，2019 年11 月末，將肥料按表1 的含量溶于1000 mL 水中，緩緩澆入幼苗根部，在整個實驗期間保持各處理組供給一致，分別于2020 年的2 月（春季）、5月（夏季）、8 月（秋季）和10 月（冬季）末在天氣晴朗的早上8 點采集測定葉綠素和生理指標的葉片；9：00—11：00 進行葉片氣體交換參數的測定；養分含量測定所需葉片在實驗結束時采集（10 月末）。

1.4 方法

1.4.1 葉綠素含量和生理指標的測定 在各處理組選取3 株長勢良好、無病蟲害的羅漢松幼苗，在樹冠中部各個方向上選擇10～12 片完整的成熟功能葉片，放入冰盒，帶回實驗室測定。采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定超氧化歧物酶（SOD）活性；采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定可溶性蛋白含量；采用酸性茚三酮比色法測定游離脯氨酸（Pro）含量；采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛（MDA）含量；采用丙酮-乙醇混合液提取法測定[13]葉綠素含量；采用愈創木酚比色法測定[14]過氧化物酶（POD）活性；采用蒽酮比色法測定[15]可溶性糖含量。

1.4.2 葉片光合生理指標的測定 從各處理組挑選3 株無病蟲害且長勢基本一致的完整植株葉片，采用Li-6400 便攜式光合測定儀每株取3 片完整的成熟葉片進行光合參數測定，得到羅漢松幼苗葉片凈光合速率（P）、細胞間CO濃度（C）、氣孔導度（G）和蒸騰速率（T）。

1.4.3 葉片養分含量測定 從各處理組葉片中隨機選擇2～3 片測定植物體內養分含量。葉片經HSO-HO 消煮后，使用凱氏定氮法測定羅漢松幼苗葉片全氮含量，使用鉬銻抗比色法測定植物全磷含量[16]。

1.5 數據處理

運用Excel 軟件對數據進行整理，利用SPSS25.0 軟件進行雙因素方差分析，使用origin 2018軟件制圖。表格和圖中的數據均以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 不同磷環境下施加氮肥羅漢松幼苗生理響應

由表2 可知，羅漢松幼苗可溶性蛋白含量受氮添加主效應及氮磷交互效應影響，POD 活性則同時受到氮添加和環境磷含量主效應影響。如圖1 所示，羅漢松幼苗可溶性糖、Pro、MDA 含量和SOD 活性在實驗期間均呈先降低后增加的趨勢，POD 活性和可溶性蛋白含量則呈無規律的變化趨勢。羅漢松幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量在低磷環境下隨著氮濃度的增加而升高，與高氮濃度相比，低氮濃度平均增加35.4%和26.6%；在高磷環境下可溶性蛋白和可溶性糖含量，隨著氮肥濃度的增加呈先增加后降低，中氮濃度下含量最高，高氮濃度則明顯降低了可溶性蛋白和可溶性糖積累，與低氮濃度相比，分別平均下降了16.7%和4.7%。隨著磷肥濃度的增加，低氮和中氮水平下，羅漢松幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量增加；相反，在高氮濃度下，增加磷肥濃度其含量下降， 較低磷環境分別下降了26.5% 和16.2%；氮肥和磷肥濃度增加均促進了POD 活性升高。

雙因素方差分析表明（表2），羅漢松幼苗Pro含量同時受環境磷含量主效應和氮磷交互效應的影響，SOD 活性主要受氮添加和環境磷含量主效應的影響，MDA 含量則受氮磷交互效應影響顯著。由圖1 可知，在不同的磷環境下，中濃度氮肥促進了羅漢松幼苗SOD 活性，低磷和高磷環境分別比低濃度氮肥處理組增加10.6%和5.9%，而高氮濃度則降低了SOD 活性；增加氮肥濃度，低磷環境下MDA 和Pro 含量均下降，高磷環境下MDA 含量增加，中氮濃度Pro 含量降低，高氮濃度Pro 含量上升。相同氮水平下，羅漢松幼苗SOD活性隨磷肥濃度增加而升高，而Pro 和MDA 含量則在低氮和中氮濃度隨著磷肥的增加而降低，高氮濃度隨著磷肥濃度的增加而增加。

2.2 不同磷環境下施加氮肥羅漢松幼苗葉綠素含量變化

氮素是植物合成葉綠素的重要原料，雙因素方差分析表明，葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb）僅受氮添加主效應影響（表3）。羅漢松幼苗葉綠素含量在整個實驗期間呈現先增后降的變化趨勢。在圖2 中，高磷環境下，高氮處理組羅漢松幼苗葉綠素a/葉綠素b 含量在整個實驗期間呈逐漸降低的趨勢，其余處理組則夏季和秋季上升，冬季下降。中濃度的氮肥在低磷和高磷環境下均顯著促進了羅漢松幼苗葉綠素a 和葉綠素b 的含量積累，相對低氮處理組平均增幅為32.45%和20.8%；低磷和高磷環境下，高濃度氮肥均減少了葉綠素a 和葉綠素b 含量的積累，低磷環境下高氮處理組低于中氮處理組但高于低氮處理組，高磷環境下高氮處理組低于低氮處理組，相較低氮處理組平均下降18.1%。低氮和中氮濃度下，磷肥濃度增加羅漢松幼苗葉綠素a、b 和總葉綠素含量增加，相反，高氮處理下磷肥濃度增加，羅漢松幼苗葉綠素a、b 和總葉綠素含量的增加量減少。

2.3 不同磷環境下施加氮肥羅漢松幼苗光合生理特性響應

氮肥能夠通過影響植物葉綠素含量間接影響植物光合作用。雙因素方差分析結果表明，羅漢松幼苗葉片G 同時受氮添加、環境磷含量主效應及二者交互效應影響，C 受氮添加和環境磷含量主效應影響，T 則主要受氮添加主效應及氮磷交互效應的影響（表4）。如圖3 所示，羅漢松幼苗P 和C 夏季和秋季高，春季和冬季低，G 和T各處理變化趨勢不一，無統一的規律。隨著氮肥濃度增加，低磷環境高氮處理羅漢松幼苗葉片的P、G 和T 最高，分別較低氮處理上升28.5%、36.15%和50.3%；高磷環境中氮處理組P、G 和T 最高，顯著高于低氮和高氮處理組，高氮濃度下P、G 和T降低；C 則隨氮濃度的增加低磷環境下降低，高磷環境下先降后升。低氮和中氮水平高磷環境羅漢松幼苗葉片P、T和G 較低磷環境升高，高氮水平高磷環境P、T 和G 較低磷環境下降；相同氮水平下，磷濃度增加羅漢松幼苗Ci 增加。

2.4 不同磷環境下施加氮肥羅漢松幼苗葉片養分含量變化

由表5 可知，羅漢松幼苗葉片N 含量僅受氮磷交互效應影響，P 肥則同時受到氮添加、環境磷含量主效應及二者交互效應影響。葉片養分含量關系植物營養狀況，如圖4 所示，隨著氮肥濃度增加，低磷環境中氮和高氮處理組羅漢松幼苗葉片N 含量較低氮處理組顯著增加（圖4A），高磷環境下則隨氮肥濃度增加而降低；供氮濃度對葉片P 含量的影響均表現為隨著供氮濃度的增加，葉片P 含量下降（圖4B），且高磷環境下低氮、中氮和高氮處理組間差異顯著（P<0.05）。低氮水平下，高磷環境羅漢松幼苗葉片N 含量較低磷環境顯著增加，中氮和高氮水平則降低；高磷環境顯著促進了葉片P 含量的積累，其中，低氮和中氮處理組間差異顯著（P<0.05），高氮處理則差異不顯著（P>0.05）。

2.5 羅漢松幼苗各指標相關性分析

植物體內的各指標協同作用，共同為植物的生長發育提供保障。如表6 所示，各指標相關性分析表明，羅漢松幼苗葉綠素含量與Tr、POD、Gs、可溶性蛋白和Ci 呈顯著正相關；可溶性糖含量與P和T 呈顯著正相關，可溶性蛋白含量與MDA、POD和T 呈顯著正相關；抗氧化酶SOD 與P、G 和T呈顯著正相關，POD 與C呈極顯著正相關；葉片Pro 含量和MDA 含量呈極顯著正相關；羅漢松幼苗光合生理系統相關指標之間存在極顯著的正相關關系，Tr 與葉片N 含量呈顯著正相關。

3 討論

3.1 羅漢松幼苗生理特性對不同氮磷濃度的響應

植物的生理特征是植物體內物質代謝的表征，外界環境變化會引起植物體內代謝進程改變。SOD 酶和POD 酶是植物在長期適應環境中進化出的保護酶，植物通過調節酶活性來清除體內活性氧，維持植物正常的生理代謝[17]；Pro 是植物體內重要的滲透調節物質，對于脅迫環境下植物細胞膜和酶的保護具有重要意義，MDA 是植物處于逆境時體內積累的活性氧加劇細胞膜脂過氧化的主要產物，是量化細胞膜受損傷程度的重要指標之一[18]，可溶性蛋白能夠提高細胞保水能力，可溶性糖是植物體內生物化學進程的表征[19]；研究表明，施加適量氮肥能夠減緩細胞膜損傷，提高植物內源酶活性，降低MDA 含量[20]，促進植物可溶性糖和可溶性蛋白的積累，緩解植物在原生環境下受到的傷害，而過高的氮則會引起植物對脅迫環境的敏感。楊潔等[21]研究，POD 活性在不同氮水平下活性不同，中氮和高氮促進了POD活性，低氮則活性降低；在本研究中，在不同的磷環境下，在中氮濃度下SOD 活性最高，高氮濃度下SOD 活性下降，POD 活性則隨著氮肥濃度的增加而升高，這表明高氮濃度降低了SOD 活性，卻促進了POD 活性，低磷環境下POD 活性的增高清除了植物在原生環境積累的大量活性氧，減緩了原生環境下細胞膜損傷程度，植物體內Pro 含量和MDA 含量下降，羅漢松幼苗體內物質代謝加快，可溶性糖和可溶性蛋白含量增加；高磷環境下，高氮水平則對植物生理構成了脅迫，植物體內產生大量自由基，POD 對活性氧清除效率下降，植物體內Pro 含量增加以增強對氧化酶的保護，從而減緩活性氧對細胞膜損傷，但大量活性氧加劇了植物細胞膜脂過氧化，MDA 含量增加， 羅漢松幼苗物質代謝效率降低，可溶性糖和可溶性蛋白含量降低。此外，在本研究中，高磷環境下不同氮水平羅漢松幼苗POD 和SOD 活性要高于低磷環境下其活性，而高磷環境下高氮濃度則成為羅漢松幼苗生理代謝脅迫因子，可溶性糖和可溶性蛋白含量相較低磷環境下降，Pro 和MDA 含量增加。相關性分析表明，可溶性糖和可溶性蛋白是植物能源物質，光合作用的增強和葉綠素含量的積累對其含量的積累有正向的促進作用，酶活性的增加清除植物體內自由基，促進了植物葉綠素含量的積累，Pro 和MDA 是反映植物抗性的指標，均在植物受到脅迫時增加，二者具有正向的相關性。

3.2 羅漢松幼苗光合特征對不同氮磷濃度的響應

葉綠素是植物吸收和利用光能，產生能量物質的基礎，其含量能夠反映植物光合作用大小，常被作為指導農業施肥的依據[22]；植物葉片P、G、C 和T 是表征植物光合作用內在特征的重要指標[23]。在本研究中，羅漢松幼苗葉綠素a、b與P、T和G 變化趨勢相同，均在夏季和秋季升高，冬季降低，這主要是由于夏秋光合有效輻射最強，葉綠素可捕獲的光能增多，提升了羅漢松幼苗Pn，葉片氣孔擴張，為減少高溫對葉片的灼傷，幼苗葉片Tr 增強[24]。土壤環境中氮磷元素影響著植物的生長發育，主要參與構成植物葉綠體中類囊體蛋白氮[7]，植物生長環境中氮磷缺乏時，施加氮磷肥能夠顯著促進植物葉綠素含量增加和光合速率提升[25]，研究表明增加土壤氮肥濃度可促進冬小麥旗葉（Triticum aestivum）[26]和虎耳草（Saxifraga stolonifera）[27]葉片葉綠素合成，顯著提升其光合效率，而植物生長環境中氮磷元素過飽和時，施加氮磷肥則對植物光合作用產生抑制[28]；在本研究中，低磷環境下低氮和中氮濃度羅漢松幼苗葉綠素含量的增加促進了羅漢松幼苗Pn 的效率，葉片氣孔擴張，加速了對CO 的吸收和轉化，C值低，氣體交換速率增加，Tr 增強，高氮濃度則減緩了羅漢松幼苗葉綠素增加，但未超過植物的耐受范圍，因此植物通過提高Pn 和Tr，擴張氣孔加速對CO 能源物質的吸收來補償氮肥濃度過高產生的影響，從而維持體內穩態環境，C 值降低；高磷環境下，低氮和中氮同樣促進了羅漢松幼苗葉綠素積累，植物光合效率提高，而磷過飽和高濃度氮肥成為羅漢松幼苗環境脅迫因子，其葉綠素合成受限，葉綠素a/葉綠素b 含量降低，抗性下降，葉片Pn 和Tr 效率較低，羅漢松幼苗雖通過擴張氣孔，加速對細胞間CO 的吸收來彌補高磷環境下高氮濃度產生的脅迫，但對細胞間CO的利用效率下降，Ci 值升高。

此外，氣孔限制和非氣孔限制均會導致植物P 降低，當P 與G 變化趨勢一致時，P 的下降由G 引起，相反，則由非氣孔因素葉肉細胞的羧化能力降低引起[29]。在本研究中，隨著施加氮肥或磷肥濃度的增加，羅漢松幼苗葉片P 與G 變化趨勢一致，這表明氣孔因素是導致羅漢松幼苗Pn 下降的主要限制因子。土壤環境中磷稀缺和磷飽和均會降低米槁（Cinnamomum migao）卡爾文循環中關鍵酶的活性，使其光合能力大幅降低[30]；在本研究中，低氮和中氮濃度下磷肥濃度增加促進了羅漢松幼苗葉綠素含量增加，葉片光合效率提升，高氮濃度下磷肥濃度增加則限制了葉片葉綠素合成，光合效率降低，這可能是因為高氮濃度下高磷環境磷元素過飽和，限制了羅漢松幼苗葉綠素積累和植物光合效率增加。相關性分析表明Pn 影響植物光合速率，繼而影響可溶性糖含量的積累，P 主要受氣孔因素的限制。

3.3 羅漢松幼苗葉片養分含量對不同氮磷濃度的響

應植物葉片養分含量是判斷植物營養狀況的基礎，其關系植物光合效率和生理活性[31]。在本研究中，低磷環境下羅漢松幼苗葉片氮含量隨施加氮肥濃度的增加而顯著增加，這與大多數研究結果一致[32-33]，說明低磷的環境下，氮輸入增加了土壤可利用氮含量，植物對氮素的積累增加；高磷環境下，隨著施氮濃度的增加，羅漢松幼苗葉片氮含量下降，原因可能是因為高磷環境阻礙了植物對氮素的吸收和積累[34]；低磷和高磷環境下，羅漢松幼苗葉片磷含量隨著添加氮濃度的增加下降，這是因為土壤氮含量的增加間接影響了土壤可利用磷含量[35]，羅漢松幼苗可吸收利用的磷素含量降低；此外，高磷環境下羅漢松幼苗葉片磷含量高于低磷環境下其含量，這與蓋甜甜等[36]的研究結果一致，低磷環境下，羅漢松幼苗受環境磷限制，葉片磷含量積累少，增加磷肥濃度后，葉片磷含量顯著增加[7]，因此在土壤磷含量較低時，通過施加磷肥能夠增加羅漢松幼苗葉片磷含量。在本研究中，羅漢松幼苗葉片氮磷比在3.3～13.6 之間，這表明羅漢松幼苗生長可能主要受氮限制，其葉綠素含量和光合作用主要受氮添加主效應的調控。

綜上所述，不同磷環境下施加適量的氮肥促進了羅漢松幼苗葉綠素含量的積累和光合效率的提升，且氮磷濃度的增加明顯提升了羅漢松幼苗體內物質代謝進程，植物在原生環境下積累的損傷得到恢復，但過高的氮磷濃度則成為羅漢松幼苗環境脅迫因子，不利于其生長，在羅漢松繁殖和培育過程中，應合理施加氮磷肥濃度，高氮高磷濃度會影響其正常生長發育。