金屬有機(jī)框架富集-酶聯(lián)免疫法測(cè)定塑料包裝飲品中雙酚A

劉 鎮(zhèn)，曲麗潔

（河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北北方學(xué)院，河北張家口 075000）

雙酚A（Bisphenol A，BPA）是制造環(huán)氧樹脂等樹脂類塑料制品的原料[1-2]。隨著食品特別是飲品外包裝輕量化、便捷化發(fā)展，塑料包裝已被廣泛用于飲品保存和運(yùn)輸過程。在高溫、酸性和含有乳化劑等條件下，部分飲品包裝容器中的雙酚A 容易釋放進(jìn)入飲品，被消費(fèi)者攝入體內(nèi)，對(duì)健康產(chǎn)生不利影響[3-5]。因此，飲品中的雙酚A 含量值得關(guān)注。

分散固相萃取（Dispersive Solid-Phase Extraction，DSPE）是將固體吸附劑分散于液體分析物，將分析物從復(fù)雜基質(zhì)中分離和凈化的方法[6-7]，具有高效、易操作、快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于樣品前處理中[8-9]。金屬有機(jī)框架（Metal Organic Frameworks，MOFs）是有機(jī)聚合物形成的三維結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為有規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)和大的比表面積，可以作為固相萃取的良好材料[10-12]。酶聯(lián)免疫法是一種利用抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法，具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域[13-15]。本試驗(yàn)合成金屬有機(jī)框架材料，利用該材料研發(fā)一種塑料包裝飲品雙酚A 含量測(cè)定的前處理方法，而后利用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測(cè)定，可顯著提高雙酚A 的檢測(cè)靈敏度，大大節(jié)省前處理步驟和時(shí)間，同時(shí)具有環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑、儀器與設(shè)備

雙酚A、無水ZrCl4、2-氨基對(duì)苯二甲酸和N,N-二甲基甲酰胺（A.R.），無水乙醇（≥99.7%），麥克林；甲醇（A.R.），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸和氫氧化鈉（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈、丙酮（色譜純），F(xiàn)isher；雙酚A 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，六角體科技。

LC-DZF-6090AB 真空干燥箱，力辰；TDZ4-WS離心機(jī)，湘儀；KQ-500B 超聲波清洗機(jī)，昆山儀器；KD200 氮吹儀，奧盛儀器；pH 計(jì)，雷磁；渦旋振蕩器，IKA；LC-FA2004 電子天平，力辰；K3 酶標(biāo)儀，Thermo；SN-MWB-4 洗板機(jī)，尚儀。

1.2 方法

1.2.1 MOFs 固相萃取材料制備

取N,N-二甲基甲酰胺50 mL，加入1 g 無水ZrCl4和0.8 g 2-氨基-對(duì)苯二甲酸，超聲5 min 分散，將混合體系轉(zhuǎn)移至含有聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，120 ℃反應(yīng)24 h，冷卻后的反應(yīng)液以2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌3 次，乙醇洗滌3 次，60 ℃真空干燥，得到鋯基MOF Uio-66金屬有機(jī)框架顆粒[16-17]。

1.2.2 樣品的處理和檢測(cè)

取塑料包裝中的10 mL 飲品樣品置于15 mL 玻璃離心管中，加入0.1 g MOFs 粉末，振蕩1 min，1 000 r·min-1離心，棄去上清，向沉淀中加入1 mL甲醇復(fù)溶，離心取上清，吹干，用1 mL 0.01 mol·L-1PBS 緩沖液（pH 值為7.4）復(fù)溶殘?jiān)褂肊LISA 試劑盒檢測(cè)。

1.2.3 方法影響因素的考察

（1）樣品pH 值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。一些飲品由于含有水果成分或檸檬酸等添加劑，常表現(xiàn)為酸性，一些豆?jié){類飲品則表現(xiàn)為偏微堿性。MOFs 材料在前處理過程中扮演固相萃取的角色，將溶液中的雙酚A 吸附在MOFs 材料表面，因此有必要驗(yàn)證合成的MOFs 材料在不同pH 值溶液中的吸附性能。取去離子水將雙酚A 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至濃度為0.5 mg·L-1，分成若干份，使用鹽酸和氫氧化鈉溶液將其pH 值分別調(diào)整為2、3、4、5、6、7、8、9，按照1.2.2 方法使用MOFs 富集-ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。

（2）不同洗脫液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。設(shè)定pH 值為5，對(duì)4 管恒定濃度的BPA 水溶液（0.5 mg·L-1）中加入0.1 g MOFs 材料進(jìn)行萃取，而后離心，棄去上清，向離心管中加入1 mL 甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯進(jìn)行復(fù)溶，而后離心，取上清有機(jī)相氮?dú)獯蹈桑肞BS（pH 7.4）定容，按照1.2.2 方法使用ELISA 試劑盒檢測(cè)，計(jì)算BPA 回收率。

（3）BPA 含量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。制作一系列不同濃度（0.01 mg·L-1、0.10 mg·L-1、1.00 mg·L-1、10.00 mg·L-1和100.00 mg·L-1）的BPA 水溶液模擬飲料樣本，各取10 mL 樣本（10 mL 樣本中BPA 含量分別為0.000 1 mg、0.001 0 mg、0.010 0 mg、0.100 0 mg和1.000 0 mg）加入0.1 g MOFs 進(jìn)行BPA 的富集，而后按照1.2.2 方法使用ELISA 試劑盒檢測(cè)，計(jì)算回收率。

（4）飲品基質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。選取果汁類、茶飲料、奶、豆?jié){、功能飲料、白酒（53 度）和啤酒樣本進(jìn)行樣本加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（加標(biāo)濃度1 mg·L-1），測(cè)定回收率。

（5）飲品溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。飲品有熱飲、冷飲，溫度不同可能對(duì)MOFs材料富集BPA產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)將同一BPA 濃度（0.1 mg·L-1）的果汁樣本分成若干份，分別使溫度達(dá)到4 ℃、20 ℃、50 ℃、70 ℃，迅速加入0.1 g MOFs進(jìn)行富集而后進(jìn)行洗脫和測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品pH 值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

如圖1 所示，當(dāng)pH 處于2 ～7，雙酚A 的回收率均大于90%，當(dāng)pH 為5 時(shí)，回收率達(dá)到最高，當(dāng)pH ＞7 時(shí)，回收率隨pH 升高而下降。可能是因?yàn)樗嵝院椭行詶l件下溶液中極性基團(tuán)占據(jù)主導(dǎo)，BPA溶解度不大，當(dāng)加入MOFs 材料后，根據(jù)相似相溶的原理，BPA 由于非極性基團(tuán)的存在使其很容易吸附在MOFs 表面，隨著pH 增大，水中的氫氧根濃度增大，與BPA 作用生成的BPA 金屬鹽則更容易分散于水相，故而表現(xiàn)為MOFs 材料在堿性溶液中對(duì)BPA 分子固相萃取效果的減弱。當(dāng)pH 為9 時(shí)，回收率仍然有80%，這說明MOFs 材料可對(duì)pH 值為2 ～9的水溶液中BPA 進(jìn)行萃取并取得滿意結(jié)果，不需要對(duì)飲品的pH 值進(jìn)行調(diào)整，可以作為飲品中BPA 的富集方法。

圖1 樣品pH 值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 不同洗脫液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

如圖2 所示，甲醇和丙酮的洗脫效果較好，回收率大于95%，而正己烷和乙酸乙酯的洗脫回收率不高，小于90%。其原因可能是MOFs 材料表面有飲料水分，而正己烷對(duì)BPA 的溶解性不好，導(dǎo)致回收率不高，乙酸乙酯與水不互溶，形成油包水結(jié)構(gòu)，阻礙了其與MOFs 接觸，從而影響了洗脫效果。因而在后續(xù)試驗(yàn)中可選擇甲醇和丙酮作為洗脫劑。

圖2 洗脫液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 BPA 含量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

如圖3 所示，當(dāng)BPA 的含量低于0.010 0 mg 時(shí)，該方法具有較好的回收率，當(dāng)大于0.010 0 mg 時(shí)，隨著濃度升高，BPA 檢測(cè)回收率急劇下降。證明在水系當(dāng)中，0.1 g MOFs 材料對(duì)BPA 的吸附極限在0.010 0 mg 左右，吸附的極限約1/10 000（m/m），若BPA 含量過高，則造成水相與MOFs 相分布達(dá)到平衡，不能完全吸附。造成這一現(xiàn)象的原因可能是MOFs 材料對(duì)于BPA 的吸附主要依靠非極性結(jié)構(gòu)部分相似相溶與少量的氫鍵作用力，作用力較弱，結(jié)合位點(diǎn)有限。

圖3 BPA 含量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.4 飲品基質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

如圖4 所示，基質(zhì)為果汁、茶飲料、功能飲料的回收率均大于85%；對(duì)于啤酒來說，回收率達(dá)到83%，也比較滿意；對(duì)于奶和豆?jié){基質(zhì)來說，回收率分別為68%和75%，說明牛奶和豆?jié){基質(zhì)對(duì)于MOFs 的固相萃取效果有一定影響；對(duì)于白酒來說，回收率明顯不足（5%），原因可能是酒精含量高，BPA 與酒精的親和力強(qiáng)于MOFs，導(dǎo)致MOFs 在高度酒精體系中難以富集BPA。

圖4 不同飲品基質(zhì)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

2.5 飲品溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

如圖5 所示，不同溫度下的檢測(cè)結(jié)果并無明顯區(qū)別，說明溫度波動(dòng)對(duì)MOFs富集BPA的影響不顯著。通常情況下，熱飲更容易將塑料包裝中的BPA 溶解到飲品之中，消費(fèi)者攝入BPA 的風(fēng)險(xiǎn)更高。本試驗(yàn)證明冷飲和熱飲均可進(jìn)行MOFs 富集-ELISA 檢測(cè)工作，無須將樣本平衡至室溫，可以節(jié)省檢測(cè)時(shí)間。

圖5 飲品溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.6 方法檢出限的確定

按照1.2.2 的步驟，采用20 份空白樣品測(cè)定均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)差的方法測(cè)定方法的檢出限，結(jié)果為0.002 mg·L-1。

3 結(jié)論

劣質(zhì)食品包裝容易導(dǎo)致BPA 溶出進(jìn)入飲品，損害消費(fèi)者健康[18]。本文將MOFs 材料富集功能和酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合起來，建立了檢測(cè)塑料包裝飲品中雙酚A 的方法，能為飲料中BPA 的檢測(cè)提供便利。通過試驗(yàn)證實(shí)，該方法的檢出限達(dá)到0.002 mg·L-1，能夠滿足飲品中微量BPA 的檢測(cè)。