超高效液相色譜-串聯質譜法測定全麥粉中的赭曲霉毒素A

唐德紅，張 季，張冰雪，任 偉，張丹丹，劉 沖

（遵義市產品質量檢驗檢測院，貴州遵義 563000）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是食物中最常見的霉菌毒素之一[1]，是曲霉屬和青霉屬的真菌形成的次級代謝產物[2-4]，廣泛存在于各種食物中。其中，谷物及其副食品是赭曲霉毒素A 的主要來源，其具有較強的肝毒性、腎毒性及免疫毒性，并可能致癌、致畸、致突變[5-8]，被認為是僅次于黃曲霉毒素類的真菌毒素類致癌物[9-13]。因此，防止污染赭曲霉毒素A 的食品直接進入人類食物鏈，加強對赭曲霉毒素A的檢測具有重要意義。

近年來，用于分析食品中赭曲霉毒素A 的方法有高效液相熒光檢測法、薄層色譜測定法、酶聯免疫吸附法和高效液相色譜質譜法等，其中高效液相熒光檢測法較為常用，但該方法限制條件嚴苛，影響結果的因素較多，且實測樣品全麥粉基質較為復雜。高效液相色譜-串聯質譜法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）兼具液相色譜和質譜的特點，其靈敏度高、定量限低、選擇性強、精密度高，且具有較好的分離能力。在數據定量過程中，該方法可排除樣品中的假陽性結果，進一步確保實驗數據和結果的準確性和可靠性。

全麥粉是小麥加工制成的具有純籽粒營養的面粉，外層麩皮含有大量的粗纖維、抗性淀粉和低聚糖，對糖尿病患者身體健康尤為有利，可能會改善糖循環、降低血糖指數、血脂水平[14-16]，生活中可作為大多數烘焙食品的原料。全麥粉作為國家食品安全監督抽檢實施細則中的重點品種，赭曲霉毒素A 為其必檢項目，其主要來源于種植培育階段、收割存儲過程，受病害蟲、溫濕度、生長環境土壤氣候影響[17]，容易在作物發生霉變后產生，及時發現能有效減少其對人體的危害。

《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）和《食品安全國家標準 食品中赭曲霉毒素A 的測定》（GB 5009.96—2016）對谷物類、豆類、酒類、咖啡類等的限量值及相關要求進行了規定，但由于小麥粉粒徑較細，經原料直接粉碎后麩皮含量高、顏色深，基質復雜，常規的凈化方法處理雜質不完全，受基質影響較大導致回收率低?；诖?，本實驗在國家標準的基礎上，以未知濃度的考核樣品、質控樣品為研究對象，選擇比較不同的免疫親和柱，鑒于赭曲霉毒素A 本身的特性優化不用的洗脫溶劑，結合高靈敏度的超高液相色譜-串聯質譜法（Ultra High Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），建立快捷高效準確的分析方法，為實際生活中測定全麥粉中赭曲霉毒素A 提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

全麥粉樣品購自國家糧食和物資儲備局科學研究院，分別為全麥粉A、全麥粉B、全麥粉C，全麥粉陰性樣品、質控樣品。

1.2 儀器

1.3 試劑

赭曲霉毒素A（OTA）標準溶液（1.9 μg·mL-1，國家糧食局科學研究院）；赭曲霉毒素A 穩定同位素（[13C]-OTA）標準溶液（0.1 μg·mL-1，奧地利Romer公司）；乙腈、甲醇均為質譜級（美國天地有限公司）；乙酸（色譜純，天津市科密歐試劑有限公司）；水為實驗室自制。

1.4 實驗方法

1.4.1 PBS 緩沖溶液的配制

準確稱量8.0 g 氯化鈉，1.2 g 磷酸氫二鈉，0.2 g 磷酸二氫鉀，0.2 g 氯化鉀，加適量水超聲使其完全溶解，加水定容至1 L。洗脫液由98 mL 甲醇和2 mL 冰乙酸混合而成。

1.4.2 標準溶液的配制

分別精密移取OTA 標準溶液、同位素內標液適量，用乙腈分別稀釋成濃度為95 ng·mL-1、20 ng·mL-1的中間儲備液，于-20 ℃冰箱中儲存。臨用時移取中間儲備液適量，用乙酸-甲醇溶液配制濃度分別為0.475 ng·mL-1、0.950 ng·mL-1、1.900 ng·mL-1、4.750 ng·mL-1和9.500 ng·mL-1的系列標準溶液，每個標準系列的溶液內標含量均為1 ng·mL-1，現配現用。

1.4.3 樣品制備

準確稱取5 g 試樣，加入一顆陶瓷均質子，準確加入20 mL 提取液（乙腈∶水=60 ∶40），置于渦旋振蕩器，2 500 r·min-1提取30 min，11 000 r·min-1離心5 min，準確移取上清液2 mL，加入10 μL 內標儲備液（濃度0.1 μg·mL-1的內標溶液），再加入13 mL PBS 溶液稀釋，混勻，11 000 r·min-1離心5 min。取出免疫親和柱，恢復至室溫。將免疫親和柱連接于注射器下，以每秒1 ～2 滴的流速使稀釋液通過免疫親和柱，用20 mL 水淋洗，棄去全部流出液，用剪去尖端的洗耳球抽干小柱，濾紙擦拭干親和柱內壁水珠。準確加入2.0 mL 冰乙酸-甲醇洗脫液，收集全部洗脫液于試管中，經0.22 μm 濾膜過濾，進樣分析。陰性樣品、質控樣品處理方法同上。

1.4.4 儀器條件

小型緊湊化是高功率脈沖驅動源的一個重要發展方向[1-4]，能夠產生近似方波脈沖的Marx發生器受到了廣泛關注[5-8]。一般將傳統Marx發生器中的電容器改為脈沖形成網絡，可使發生器輸出近似方波脈沖，再將各級脈沖形成網絡以Marx發生器的形式進行疊加，即可達到增加輸出功率、大幅減小脈沖驅動源體積的目的。

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣體積：5 μL；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫，洗脫程序：0 ～1.0 min，70%B；1.0 ～2.5 min，70%B→40%B；2.5 ～4.0 min，40%B→0%B；4.0 ～5.0 min，0%B；5.0 ～6.0 min，0%B→40%B；6.0 ～8.0 min，70%B。

（2）質譜條件。離子源為帶有Agilent 噴射流技術的電噴霧離子源；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：11 L·min-1；噴嘴電壓：35 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L·min-1；電噴霧電壓為4 000 V；采用正離子掃描模式，多反應監測模式進行檢測。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的優化

分別在正離子模式和負離子模式下，選擇Q1 MS1 全掃描模式進行母離子掃描，獲得在對應模式下的質荷比，利用Q3 MS2 碎片離子掃描模式，尋找二級質譜碎片離子。在優化過程中，發現負離子模式下母離子響應較低，且碎片離子較少，所以選擇正離子模式分析，選擇響應最高的兩個碎片分別作為定量離子和定性離子。碰撞能以5 V 為間隔，從15 V 調至50 V，優化碰撞能，觀察被測組分出峰時間，確保圖譜由12 ～15 個采集點構成，確定駐留時間，最后采用多反應監測模式進行檢測，相關定量及定性檢測離子條件見表1。

表1 赭曲霉毒素A 及其內標的質譜條件

2.2 赭曲霉毒素A 免疫親和柱的選擇

在實驗過程中，同時選擇了A、B、C 3 個不同生產廠家的具有相同柱容量和柱體積的免疫親和柱進行凈化測定，測定的原理均為基于抗原抗體反應，赭曲霉毒素A 抗體連接在柱內凝膠上，樣品中赭曲霉毒素A 抗原經過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢通過赭曲霉毒素A 免疫親和柱，在柱內與抗體結合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結合的其他物質，用洗脫液洗脫赭曲霉毒素A，注入UPLC-MS/MS 儀器中檢測。結果發現，廠家A 的免疫親和柱回收率相對偏低，且批間穩定性差異較大，廠家B 和廠家C 的免疫親和柱回收率均為85%以上，綜合考慮成本價格，最終選擇廠家B 的免疫親和柱進行本次實驗。

廠家A 回收率偏低的原因有以下幾點：①由于赭曲霉毒素A 中含有保護凝膠和抗體的PBS 溶液，只能陸路運輸，運送時間較長，無法確保整個運輸過程中的溫度與赭曲霉毒素A要求的儲藏溫度一致，可能導致回收率偏低；②免疫親和柱的柱空白，即免疫親和柱自身本底可能會干擾赭曲霉毒素A 的測定，從而影響回收率；③免疫親和柱內抗體對有機溶劑的耐受性，樣品經提取過濾，會用一定體積倍數的PBS 溶液稀釋，使其有機溶劑的含量在10%以下，以避免對抗體的破壞。

2.3 洗脫溶劑的選擇

在GB 5009.96—2016 的基礎上，優化了洗脫液和洗脫液體積，采用標準中規定的洗脫液甲醇和含2%冰乙酸的甲醇進行洗脫，結果表明含2%冰乙酸的甲醇作為洗脫液時回收率更高，可能與赭曲霉毒素A 自身結構和理化性質相關。此外，本文進一步優化了洗脫液的體積，分別采用1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL 的含2%冰乙酸的甲醇作為洗脫液，對加標的全麥粉陰性樣品進行洗脫，結果表明洗脫液體積為2.0 mL 時，回收率高于85%，洗脫液體積為1.0 mL 和3.0 mL 時，赭曲霉毒素A 回收率均偏低，可能是洗脫不完全或洗脫雜質的增加干擾了質譜的響應，最終依據實驗具體過程和操作選擇2.0 mL 含2%冰乙酸的甲醇作為洗脫液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性

精密稱取陰性樣品5 g，按1.4.3 項下方法操作處理樣品后，進樣分析，獲得陰性樣品色譜圖（圖1）；將一定濃度對照品溶液加入5 g 陰性樣品中，同樣按“1.4.3”項下方法操作，進樣分析，獲得含對照樣品色譜圖（圖2）；取待測樣品5 g，依法操作待測樣品色譜圖（圖3）。結果顯示，全麥粉中內源性物質對待測物的測定無干擾。

圖2 對照樣品中OTA 及其同位素內標MRM 色譜圖

圖3 實測樣品中OTA 及其同位素內標MRM 色譜圖

2.4.2 標準曲線、檢出限、定量限

取陰性樣品5 g，分別依次加入不同濃度的標準溶液適量，按1.4.3 項下操作處理后進樣分析，以待測物的峰面積與內標峰面積之比（A/Ai）為縱坐標，各待測物濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果表明，赭曲霉毒素在0.475 ～9.500 ng·mL-1具有良好的線性關系，其相關系數r為0.999 9，線性方程為Y=1.298X-0.043。全麥粉中赭曲霉毒素A 以3 倍信噪比確定檢出限為0.68 μg·kg-1、10 倍信噪比確定定量限為2.27 μg·kg-1。GB 5009.96—2016 中規定了全麥粉中赭曲霉毒素A 的檢出限和定量限分別為1.0 μg·kg-1和3.0 μg·kg-1，因此本方法檢出限和定量限滿足檢測需求。

2.4.3 精密度

取陰性樣品5 g，分別加入3 個不同濃度的標準溶液，分別配制含赭曲霉毒素A 的低、中、高3 個濃度（質量濃度依次為0.95 ng·mL-1、1.90 ng·mL-1、4.75 ng·mL-1）的質量控制（Quality Control，QC）樣品，按1.4.3 項下操作處理后進樣分析，每個濃度平行配制6 樣本，于1 d 連續測定考察日內精密度，每次均制備標準曲線。將QC 樣品經儀器檢測所得A/Ai代入標準曲線，計算QC 樣品的濃度，并與QC 樣品理論濃度比較，得出該方法的精密度。如表2 所示，精密度RSD ＜2%，提示該方法精密度良好，符合標準分析方法要求。

表2 赭曲霉毒素 A 的精密度試驗結果（n=6）

2.4.4 回收率

精密稱取陰性樣品5 g，分別添加赭曲霉毒素A至理論濃度為2.37 μg·kg-1、4.75 μg·kg-1、9.50 μg·kg-1，考察3 種濃度下該方法的加標回收，按1.4.3 項下樣品前處理條件進行處理并測定，每個添加濃度3 個平行樣品，計算回收率及相對標準偏差，結果見表3。由表3 可知，平均回收率在85.62%～99.42%，RSD在1.92%～4.66%，表明提取回收率良好，可用于全麥粉樣品中赭曲霉毒素A 的測定。

表3 赭曲霉毒素 A 的方法回收率（n=3）

2.5 質控樣品的測定

精密稱取質控樣品5 g，按1.4.3 項進行樣品前處理，然后進樣分析測定，測得質控樣品含量為2.62 μg·kg-1，該結果在質控樣值允許范圍內[（3.1±0.676）μg·kg-1]，表明方法可用于全麥粉質控樣品中赭曲霉毒素A 的測定。

2.6 全麥粉中赭曲霉毒素A 的測定

分別準確稱取國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油質量安全研究所研制的全麥粉中赭曲霉毒素A（低、中、高）3 濃度水平質控樣品5 g，每份稱取6個平行，按優化好的前處理方法提取凈化后，進樣分析檢測，結果如表4 所示。3 個樣品含量分別為（2.15±0.07）μg·kg-1、（4.20±0.14）μg·kg-1、（8.26±0.18）μg·kg-1，且6 次獨立實驗的RSD 較小，提示該方法重現性好、穩定性高，可用于較為復雜基質中赭曲霉毒素A 的測定。

表4 樣品中赭曲霉毒素A 的測定結果

3 結論

赭曲霉毒素A 是廣泛存在的具有較強毒性的真菌毒素，對人類健康有潛在風險，建立健全高效準確快速的檢驗方法，有利于保障食品安全。本研究在現行檢測赭曲霉毒素A 的國家標準的基礎上，優化了前處理方法，采用同位素內標法處理樣品，以減少實驗誤差，消除基質效應及離子化干擾，提高檢測結果的可靠性和準確度；同時結合UPLC-MS/MS方法進行分析檢測，較常用的液相色譜而言，不僅可以保留時間定性，同時能夠滿足定量離子、定性離子同時出峰，且與標準品一致，且離子豐度比達到要求，優化后的方法有效避免了假陽性結果，能夠保證結果的準確性。此外，由于全麥粉色澤較深，麩皮細膩，選擇免疫親和柱法凈化，樣品更清潔，可減少復雜的基質干擾，但免疫親和柱本質為抗原抗體特異性結合，因此確保親和柱的有效性至關重要。結合最終結果可知，本方法可為全麥粉中赭曲霉毒素A 的快速準確分析檢測提供參考，可為人們的健康安全提供保障。