液相色譜串聯質譜內標法測定豬肉中沙丁胺醇的不確定度分析

楊 翠

（甘孜州食品藥品檢驗所，四川甘孜 626000）

沙丁胺醇（Salbutamol）屬于一種具有選擇性的β受體激動劑，能進行性激動支氣管平滑肌的β 受體的選擇，擴張支氣管[1-3]。臨床上常用于預防治療支氣管哮喘[4]。飼喂畜禽沙丁胺醇能夠加快畜禽的骨骼肌發育速度，減少脂肪沉積[5]。我國對萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅的用途予以合法約束之后，部分不法商戶會將沙丁胺醇作為替代品用于畜禽飼喂[6]。如果促生長飼料內的沙丁胺醇含量超出正常治療量，那么動物體內會殘留一定的沙丁胺醇，而人們食用有沙丁胺醇殘留的動物食品后，會出現中毒反應[7]。目前，應用相對較為廣泛的沙丁胺醇殘留檢測方法主要有氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜聯用法等[8-10]。

質譜分析法是通過測定被測樣品離子質荷比進行分析[11]，液相色譜串聯質譜儀由接口裝置、高效液相色譜、質譜儀組成，其作用是先分離混合物樣品，再進入質譜儀[12]。液相色譜串聯質譜是檢測沙丁胺醇的較為高效的檢測方法[13]，這種檢測方法不涉及衍生化環節，利用液相色譜可以有效分離出部分熱不穩定小分子極性物質，質譜能精準檢測其中的化合物[14]。部分檢測中運用液相色譜串聯質譜法對動物肝臟中沙丁胺醇含量進行綜合檢測分析，通過檢測得出其平均回收率為76%，不同樣品之間的相對標準偏差為6%[15]。孫雷等[16]綜合闡述了檢測分析動物源食品中沙丁胺醇的多種方法，發現食品中沙丁胺醇含量極值為0.1 μg·kg-1。蔡欣欣等[17]結合內標法對動物源食品進行檢測分析，主要測定了沙丁胺醇含量，得出其最低定量限為0.2 μg·kg-1。朱英才等[18]通過超高效液相色譜-串聯質譜法綜合檢測分析豬尿內的沙丁胺醇殘留量，沙丁胺醇回收率為93.8%，最低定量限為0.27 μg·L-1。谷旭等[19]運用超高壓液相色譜-飛行時間質譜法檢測分析了豬尿液和相關代謝物內的沙丁胺醇含量，運用乙腈對豬尿樣品進行處理，在樣本中沙丁胺醇的保留時長可達1.8 min，沙丁胺醇特征離子對應的質荷比達240，沙丁胺醇進入豬體內之后6 h 內的尿液中檢測分析出的代謝產物相對較多，結果顯示發現了5 種不同的代謝產物，其中2 種代謝產物在以往的報道中未發現[20]。液相色譜串聯質譜法具備樣品用量少[21]、靈敏度高[22]、選擇性強[23]等多種優勢，成為現階段開展沙丁胺醇測定的主要方法之一。基于此，此次主要按照《測量不確定度評定與表示》（JJG 1059.1—2012）以及《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL06：2019）的規定，分析了液相色譜串聯質譜內標法測定豬肉中沙丁胺醇的不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（LC-MS 級），購自山東夸克化工有限公司；β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，購自美國Sigma-Aldrich 公司；乙酸鈉（優級純），購自湖北萬得化工有限公司；高氯酸（優級純），購自金川縣金星氯酸鹽廠；甲酸，購自美國Fisher 科學世界公司；氨水（優級純），購自河北正坤精細化工有限公司；氫氧化鈉（優級純），購自上海巨鵬化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀串聯質譜儀（安捷倫1290-6470），ESI+ Agilent Jet 源；安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；梅特勒電子天平XS205DU；Oasis MCX 陽離子交換柱，60 mg/3 mL；TurboVap 氮吹儀，瑞典Biotage 儀器設備公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2 g（精確到0.01 g）完全搗碎的樣品并放置到規格為50 mL 的塑料管內，在塑料管中倒入8 mL的乙酸鈉緩沖液，使其均勻混合，放入β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，劑量為50 μL，混勻，放置于37 ℃的水浴中水解，時間設定為12 h。把100 μL劑量規格為10 ng·mL-1的內標工作液倒至待檢測樣品中。塑料管加蓋后放入水平振蕩器內，時間設定為15 min。放入轉速為5 000 r·min-1的離心機內，時間設定為10 min。取4 mL 離心后的上清液，放入5 mL 濃度為0.1 mol·L-1的高氯酸溶液，混勻，在液體內放入一定量的高氯酸，將液體pH 值調整到1±0.3。設定離心機轉速為5 000 r·min-1，時間設定為10 min，取出離心后的所有上清液，放置于規格為50 mL 的離心管內，放入一定量的10 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，把試管內液體pH 值調整到11。在溶液中加入飽和氯化鈉溶液、異丙醇-乙酸乙酯混合溶液各10 mL，待其完全提取后，放入轉速為5 000 r·min-1的離心機內，時間設定為10 min。40 ℃水浴，并通過氮氣，使其干燥。放入5 mL 乙酸鈉緩沖液，樣品溶液超聲混勻，全部溶解殘渣部分并留作備用。

把陽離子交換小柱以及真空過柱裝置連接到一起，把殘渣溶液加入真空柱中，分別用2 mL 水、2%甲酸水溶液、甲醇3 種不同液體對柱子進行洗滌，洗滌后及時抽干洗滌液體，利用5%氨水甲醇溶液完全清除柱子內留存的部分待測成分。在洗脫過程中，應將流速控制在0.5 mL·min-1。將洗脫液放置于40 ℃水浴中并且利用氮氣使其干燥。在樣品溶劑中加入200 μL規格為0.1%的甲酸/水-甲醇溶液（95+5）并對其進行超聲混勻，把溶液移至1.5 mL 離心管內，放入轉速為5 000 r·min-1離心機內，時間設定為10 min，對離心后的上清液進行液相色譜串聯質譜測定。

1.3.2 標準溶液配制

配制規格為1 000 mg·L-1的沙丁胺醇標準儲備溶液，精準稱取0.009 21 g 的沙丁胺醇，溶解，溶液容積設定為50 mL，于4 ℃貯存，保存期為6 個月。配制沙丁胺醇-D3混合標準中間溶液（100 mg·L-1），精準量取1 mL 丁胺醇標準儲備溶液，放入規格為100 mL 的容量瓶內，用甲醇定容。配制5 ng·L-1的沙丁胺醇溶液，試劑配制濃度測定值為4.832 1 ng·L-1、4.867 1 ng·L-1、4.864 4 ng·L-1，基質配制測定值為5.438 2 ng·L-1、5.504 5 ng·L-1、5.441 6 ng·L-1。

1.3.3 數學模型

待檢測樣本內的沙丁胺醇殘留量的計算公式為

式中：X為待檢測樣本內的沙丁胺醇殘留量，μg·kg-1；c為配制的標準工作溶液中的沙丁胺醇濃度，ng·mL-1；csi為標準工作溶液中含有的內標物濃度，ng·mL-1；ci為樣品中的內標物濃度，ng·mL-1；A為樣品內的沙丁胺醇能夠形成的峰面積；Asi為標準工作溶液內的內標物能夠形成的峰面積；Ai為樣品內的內標物能夠形成的峰面積；As為標準工作溶液內所含沙丁胺醇能夠形成的峰面積；V為樣品的定容體積，mL；m為樣品的稱樣量，g。

2 結果與分析

2.1 標準物質定容及稀釋過程中引入的不確定度

2.1.1 標準品定容引入的不確定度

在標準儲備液（182.911 mg·L-1)配制中，容量瓶定容誤差會引入不確定度。容量瓶規格50 mL，容量瓶允差為±0.05 mL，結合三角分布，其標準不確定度為

將溫度引入不確定度中，校準容量瓶所需溫度設定為20 ℃，而實驗室內溫度通常控制在（20±2）℃，受到水膨脹系數（2.08×10-3℃-1）影響，假定溫度變化為均勻分布，則對應的標準不確定度為

定容引入的不確定度為

標準品定容引入的相對標準不確定度為

2.1.2 標準溶液稀釋引入的不確定度

標準溶液稀釋引入的不確定度包括移液器移取體積、移取溫度的不確定度和容量瓶定容體積、定容溫度的不確定度，計算結果見表1。

表1 標準溶液稀釋引入的不確定度

標準物質稀釋過程引入的相對標準不確定度為

標準物質配制及稀釋過程引入的標準不確定度為

2.2 內標引入的不確定度

2.2.1 內標物質純度引入的相對標準不確定度

本次使用的沙丁胺醇-D3液體標準品濃度為100.1 μg·mL-1，查看標準物質證書，得出其相對擴展不確定度是3.0%，k=2，標準物質引入的不確定度為

2.2.2 內標溶液稀釋引入的相對標準不確定度

所用移液器為1 mL，查看檢定證書，得出擴展不確定度U=2.1 μL，k=2。相對標準不確定度為

所用容量瓶為100 mL，容量瓶允差為±0.10 mL，按均勻分布考慮，其標準不確定度為

校準容量瓶時溫度應是20 ℃，而實驗室內溫度通常控制在（20±2）℃，在甲醇膨脹系數的作用下，如果溫度處于均勻分布發展狀態，則其標準不確定度為

內標引入的相對標準不確定度為

2.3 標準曲線配制引入的不確定度

標準曲線配制共有8 組不同濃度的溶液，計算獲得不確定度，結果見表2。標準曲線配制形成的相對標準不確定度為

表2 標準曲線配制不確定度

2.4 沙丁胺醇標準曲線擬合引入的不確定度

沙丁胺醇標準曲線擬合引入的不確定度的計算公式為

式中：b為標準曲線斜率；沙丁胺醇標準溶液濃度平均值，mg·L-1；為樣品中沙丁胺醇濃度的平均值，mg·L-1；x—樣為樣品中沙丁胺醇含量的平均值，mg·kg-1；p為測試樣品的次數，p=18；n為檢測中標準品的檢測次數，n=24；x為標準溶液對應的濃度平均值，mg·L-1。

進行樣品中沙丁胺醇濃度的6 次平行試驗，對樣品中沙丁胺醇含量進行測試，并計算其平均值，樣品測定結果見表3，計算標準差（Standard Deviation，SD）和變異系數（Coefficient of Variation，CV）。

表3 樣品含量計算結果

以工作液濃度為橫坐標、內標峰面積為縱坐標，擬合得到沙丁胺醇濃度不確定度工作曲線數據，見表4。

表4 沙丁胺醇濃度不確定度工作曲線數據

標準偏差s=0.212 2；標準曲線工作液濃度的平均值=25.505 0 ng·mL-1

沙丁胺醇校準曲線產生的不確定度為

2.5 樣品引入的不確定度

2.5.1 樣品稱量引入的不確定度

準確性引入的不確定度在檢定證書內設定最大公允差為0.000 5 g，假設為均勻分布，則重復性引入的不確定度檢定證書內設定的重復性誤差是0.000 2 g，假設為均勻分布，則

偏載引入的不確定度由檢定證書給出的誤差為0.000 1 g，假設為均勻分布，則

天平稱量引入的合成不確定度為

樣品稱量引入的相對標準不確定度為

2.5.2 樣品定容引入的不確定度

樣品定容所用可調移液器規格為1 000 μL，允 差 為±1.0%， 測 量 重 復 性 為0.5%， 按均勻分布考慮， 定容體積標準不確定度為定容重復性標準不確定度為

校準容量瓶時溫度為20 ℃，實驗室溫度變化為（20±2）℃，由水的膨脹系數（2.08×10-4℃-1）決定，假定溫度變化為均勻分布，其標準不確定度為

定容引起的合成不確定度為

樣品定容引入的相對標準不確定度為

樣品引入的相對標準不確定度為

2.6 高效液相色譜儀串聯質譜儀引入的不確定度

由儀器檢定證書知，儀器的擴展不確定度為U=0.15，k=2，其相對標準不確定度為

2.7 測量重復性引入的不確定度

由表2 可知，樣品測定結果為S(x)=0.16，x—=28.3 μg·kg-1，所以相對標準不確定度為

2.8 沙丁胺醇相對合成標準不確定度

通過計算樣品稱量、定容、標準品、內標、標準曲線配制、標準曲線擬合、儀器設備、樣品重復性測定的相對不確定度，計算得出豬肉中沙丁胺醇相對合成標準不確定度為

2.9 合成標準不確定度

豬肉中沙丁胺醇的合成標準不確定度為

2.10 測量不確定度報告

取置信區間為95%，k=2，則擴展不確定度為U=ucrel(x)×k=2.238 5×2=4.477 μg·kg-1，樣品中沙丁胺醇含量為（28.3±4.477）μg·kg-1。

3 結論

本文研究了液相色譜串聯質譜內標法測定豬肉沙丁胺醇的不確定度，主要分析樣品前處理、標準品及內標配制過程、標準曲線擬合、儀器設備、溫度等多種相關因素對不確定度的影響，各影響因素均對不確定度有一定的貢獻。結果顯示，此次試驗中的不確定度主要來自高效液相色譜儀串聯質譜儀、標準曲線配制、內標物質純度。在實際檢測時，玻璃量器的校準、天平定期檢定以及加大實驗室內的溫度控制等在提升檢測可靠性以及準確性等方面具有重要意義。根據對不確定度的分析可知，液相色譜串聯質譜儀的性能狀態對檢測結果影響最大。因此，維護保養設備至關重要，維持設備的精密度和靈敏度，可保證檢驗結果準確可靠。