兩種柱前衍生法測定奶粉中牛磺酸的比較研究

康紹英，劉宇星，趙紅清，李 燦，劉 蘭，張 新

（湖南省產商品質量檢驗研究院，食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南長沙 410017）

牛磺酸又名2-氨基乙磺酸、牛膽素、牛膽酸，因最早從牛黃中提取出來而得名。牛磺酸是一種含硫氨基酸，但并不是蛋白質的組成成分，這種非蛋白氨基酸不參與體內蛋白的生物合成，以游離氨基酸形式存在于人體內。作為一種特殊的氨基酸，其對人體健康非常重要，是人體必不可少的營養元素。研究表明牛磺酸具有保肝利膽、降低血壓，調節內分泌、抗驚厥和心律紊亂、預防心腦血管疾病、抑制血糖升高、提高免疫力、抗疲勞等生理作用，特別是對嬰幼兒提高智力發育、神經傳導和視覺功能以及鈣的吸收有著非常重要的作用，是一種促進嬰幼兒生長發育的重要營養素。研究發現，嬰幼兒如果缺乏牛磺酸，會導致中樞神經系統發育緩慢，造成智力低下、視覺功能紊亂等不良后果。牛磺酸廣泛存在于人和動物的腦、心臟、肝、腎及乳汁中。嬰兒主要從母乳中獲得牛磺酸，而牛奶中幾乎不含牛磺酸，所以完全由人工喂養的嬰兒，可能會造成牛磺酸的缺乏，因此嬰幼兒配方奶粉中必須強化添加一定量的牛磺酸。目前我國標準《食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準》（GB 14880—2012）中規定嬰幼兒調制乳粉中牛磺酸的允許使用量為0.3～0.5 g·kg-1。

牛磺酸的主要檢測方法有薄層色譜法[1]、酸堿滴定法[2]、比色法[3]、氨基酸分析儀法[4]以及柱前衍生高效液相色譜法[4-11]等，其中最常見的牛磺酸檢測方法為柱前衍生高效液相色譜法。牛磺酸分子式中無共軛雙鍵，在紫外區無吸收，需經衍生加入紫外吸光基團方可產生吸收，從而進行含量測定。用于測定牛磺酸的主要柱前衍生劑有鄰苯二甲醛[5-7]、丹磺酰氯[4,8]、2,4-二硝基氟苯[9]、異硫氰酸苯酯[10]、9-氯甲酸芴甲酯[11]等。本研究采用鄰苯二甲醛（OPA）和丹磺酰氯（Dansyl-Cl）兩種柱前衍生高效液相色譜法測定奶粉中牛磺酸的含量，并比較了兩種方法的優劣。兩種衍生化方法靈敏度好、分離度高，均可用于奶粉中牛磺酸的測定，但實際樣品分析表明OPA法具有樣品前處理快、分析時間短、干擾少等優點，是較理想的牛磺酸測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試奶粉來源于流通領域抽取的食品安全監督抽檢樣品。

牛磺酸標準物質（國家標準物質信息中心）；甲醇、乙腈、鹽酸甲胺、丹磺酰氯（色譜純，CNW Technologies）；鄰苯二甲醛（優級純，國藥）；乙硫醇（分析純，Fluka Analytical）；硼酸（分析純，上海山浦）；氫氧化鈉（分析純，天津風船）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、鹽酸、無水碳酸鈉、乙酸鈉（分析純，國藥）。

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；BS224S電子天平、PB-10 pH計，北京賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-500B超聲波清洗機，昆山美美超聲儀器有限公司；TG16-WS離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

（1）牛磺酸標準溶液。精密稱取0.0502 g牛磺酸標準物質于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成濃度為1 mg·mL-1的標準溶液。

（2）牛磺酸標準工作液。準確吸取適量牛磺酸標準溶液，用水稀釋制備濃度為1 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、15 μg·mL-1和20 μg·mL-1的系列標準工作液。

（3）沉淀劑Ⅰ。稱取15.0 g亞鐵氰化鉀用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（4）沉淀劑Ⅱ。稱取30.0 g乙酸鋅用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（5）0.4 mol·L-1硼酸鈉緩沖液。分別稱取2.48 g硼酸、1.41 g氫氧化鈉用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（6）OPA衍生劑。稱取0.1 g OPA加10 mL甲醇溶解，再加0.1 mL乙硫醇，最后用0.4 mol·L-1硼酸鈉緩沖液稀釋至100 mL容量瓶中。

（7）1 mol·L-1鹽酸溶液。吸取9 mL鹽酸用水定容至100 mL容量瓶中。

（8）0.08 mol·L-1碳酸鈉緩沖液（pH=9.5）。稱取0.424 g無水碳酸鈉以40 mL水溶解，用1 mol·L-1鹽酸溶液調節pH值至9.5，再用水定容至50 mL容量瓶中。

（9）1.5 g·L-1丹磺酰氯溶液。稱取0.15 g丹磺酰氯，用乙腈溶解定容至100 mL容量瓶中。

（10）20 g·L-1鹽酸甲胺溶液。稱取2.0 g鹽酸甲胺，水溶解定容至100 mL容量瓶中。

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（11）0.01 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH=4.2）。稱取0.820 g乙酸鈉，用水溶解稀釋至1000 mL容量瓶中，用冰乙酸調節pH值至4.2，經0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2 試樣制備

（1）試液提取。稱取1.0 g左右試樣至100 mL容量瓶，加入80 mL 50～60 ℃溫水溶解，充分混勻后超聲提取10 min，冷至室溫。加1.0 mL沉淀劑Ⅰ混勻，再加入1.0 mL沉淀劑Ⅱ混勻，用水定容并充分混勻，提取液于5000 r·min-1離心10 min，取出上清液待衍生用。該上清液在4 ℃暗處可穩定保存24 h。

（2）試液衍生化。①OPA衍生化。準確吸取上清液2.5 mL、OPA衍生劑2.5 mL于10 mL具塞離心管中搖勻，衍生反應2 min后經0.22 μm微孔濾膜過濾，立即進樣分析，標準工作液和樣品溶液從衍生開始至上機分析的時間應盡量保持一致并控制在5 min內。②丹磺酰氯衍生化。準確吸取上清液、碳酸鈉緩沖液和丹磺酰氯溶液各1.00 mL于10 mL具塞玻璃試管中，充分混勻在室溫條件下避光衍生反應2 h（中間振搖1次），加0.10 mL鹽酸甲胺溶液搖勻終止衍生反應，避光靜置沉淀取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾待分析用。衍生后的溶液在4 ℃避光條件下可保存48 h。標準工作液與樣品溶液同步衍生。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；OPA法流動相：乙腈∶水=10∶90；檢測波長：335 nm；丹磺酰氯法流動相：10 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液∶乙腈=80∶20；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

在堿性條件下牛磺酸與OPA衍生試劑發生衍生反應，生成具有紫外吸收的衍生產物。衍生產物光譜圖顯示在335 nm處具有最大吸收峰，因此OPA法檢測波長為335 nm。同樣在堿性條件下牛磺酸與丹磺酰氯發生衍生反應生成具有紫外吸收的衍生產物，該產物在254 nm處具有最大吸收，因此丹磺酰氯法檢測波長為254 nm。

2.1.2 流動相的優化

OPA衍生法采用乙腈-水作為流動相，并分別考察了30%、20%、10%的乙腈-水對牛磺酸分離的影響，最終選擇10%乙腈-水作為流動相，牛磺酸在6 min左右出峰，且樣品檢測無雜質干擾。

丹磺酰氯衍生法首先以10 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液∶乙腈=70∶30為流動相，實際樣品分析時測得某奶粉牛磺酸含量為標簽標示值的2倍，而用OPA衍生法測得其牛磺酸含量與標簽標示值一致，進一步優化流動相比例發現該衍生方法衍生產物中存在干擾目標分析物檢測的組分，且干擾物衍生產物的光譜圖和牛磺酸衍生產物的光譜圖完全一致，當乙酸鈉緩沖液與乙腈的比例為80∶20時，干擾成分與目標物完全分離，測得奶粉樣品中牛磺酸的含量與標簽標示含量基本一致，因此丹磺酰氯衍生法以乙酸鈉緩沖液∶乙腈=80∶20為流動相。

2.2 方法驗證結果

2.2.1 方法的線性范圍及檢出限

將不同質量濃度水平的標準工作溶液分別采用兩種衍生法衍生后于優化的色譜條件下依次進樣分析，以分析物峰面積（Y）對質量濃度（X）繪制標準工作曲線，得到牛磺酸的標準曲線、線性回歸方程及相關系數。由表1可知，兩種方法在1～20 μg·mL-1線性關系良好，相關系數r分別為0.9999和0.9996，方法檢出限均為1.5 mg/100 g，結果見表1。

表1 牛磺酸的線性關系和檢出限

2.2.2 回收率及重復性結果

分別稱取1 g（精確至0.01 g）奶粉試樣于100 mL容量瓶中，以3種濃度水平進行加標回收實驗，每個濃度水平各分別制備5份測試溶液進行測定，分別計算各濃度添加水平的平均測定值、平均回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表2可知，兩種方法均可獲得較好的回收率，相對標準偏差≤4.30%。

表2 回收率及重復性比較（n=5）

2.3 兩種方法優缺點討論

OPA衍生劑是目前應用最為廣泛的測定牛磺酸的柱前衍生試劑。實際樣品檢測表明OPA衍生法具有諸多優點，如OPA衍生劑本身不會干擾目標物的分離檢測，過量試劑不必除去；衍生反應迅速，2 min內即可完成；衍生產物出峰快，分析一個樣品僅需10 min。但OPA衍生法的最大缺點是衍生產物不穩定，要求衍生反應結束后必須在很短的時間內完成進樣分析，且每份樣品的時間必須保持一致，因此嚴格控制衍生反應時間及進樣分析時間是獲得較好的重復性的必備條件；樣品不能批量處理；衍生過程中需加入乙硫醇，乙硫醇氣味大且毒性較大。如色譜儀配備有在線衍生系統，則可實現在線衍生化反應，能夠很好地解決以上缺點。無在線衍生條件的實驗室，只要衍生時間和進樣時間控制好，也很容易獲得滿意的重復性。

衍生劑丹磺酰氯目前也被較多地應用于牛磺酸的測定中，該衍生法具有前處理操作簡便、數據準確、重現性好等特點，其主要優點是衍生產物非常穩定，在4 ℃可避光保存48 h，樣品能夠批量處理。但此衍生法亦有不足之處，如衍生反應時間長，需要2 h；需加入淬滅劑終止反應以除去過量試劑；衍生產物干擾成分多，色譜分析時間較長。

3 結論

本實驗比較了OPA和丹磺酰氯兩種柱前衍生法測定奶粉中牛磺酸的檢測方法。結果表明，兩種方法線性關系良好，回收率高，靈敏度高，測定結果準確、重現性好，均可用于奶粉中牛磺酸的測定。但丹磺酰氯法衍生反應慢，分析耗時長、干擾多。與之相比OPA法具有樣品前處理時間短、分析時間短、分離效果好等優點，其衍生產物不穩定、樣品不能批量處理，但可運用在線衍生系統解決，是較為理想的牛磺酸測定方法。