GC-MS/MS法測定發酵食品中氨基甲酸乙酯的含量

陳大鵬

（黑龍江農業職業技術學院，黑龍江佳木斯 154000）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）是發酵食品在發酵與儲存過程中形成的污染物，屬于2A類致癌物，廣泛存在于黃酒、醬油等食品中[1]。《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》（GB 5009223—2014）針對食品中EC的測定制定了詳細的標準，表明了國家對其測定工作的重視程度[2]。目前，EC測定方法主要有氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、氣相色譜-質譜聯用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、分子印跡法和免疫分析法等，而上述方法存在定量不準確等問題[3]。考慮到EC廣泛存在于各類發酵食品中，本文提出采用氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法進行發酵食品中EC的測定，了解發酵食品中EC的污染情況，從而識別其食品安全風險，指導消費者合理飲食[4]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白酒、料酒、醬油、醋、腐乳、發酵乳、豆豉以及面包，市售。

Agilent 7890A/7000bGC-MS/MS三重四極桿氣相色譜串聯質譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Sartorms CPA225D電子天平，德國賽多利斯公司；TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；HP-5016SY氮吹儀，上海濟成分析儀器有限公司；默克Milli-Q超純水機，美國Millipore公司；MS3基本型渦旋混合器，德國IKA公司；ST-700A攪碎機，常州國華電器有限公司。

EC標準品（純度＞99%），德國Dr．Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯，美國TEDIA公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；色譜級甲醇、乙腈，美國Burdick-Jackson公司；硅藻土萃取柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；D5-氨基甲酸乙酯，CDNISOTOPES。

1.2 標準溶液配制

稱取10 mg EC標準品于10.0 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1 mg·mL-1的標準儲備液，采用同樣的方式制備質量濃度為1000 μg·L-1的D5-氨基甲酸乙酯內標使用液。將不含有EC成分的同基質物質作為空白樣品，適量吸取質量濃度為1000 μg·L-1的混合對照品中間液，采用氮吹儀吹至近干，制備成1 mg·mL-1基質標準使用液。分別吸取0.01 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和3.20 mL中間液，采用乙酸乙酯定容，制備成質量濃度為1 μg·L-1、l0 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、160 μg·L-1和320 μg·L-1的EC標準系列溶液。

1.3 樣品前處理

液體基質：樣品搖勻后稱取1 g放入10 mL試管中，加入25 μL 10 μg·mL-1內標中間液，除了醬油以外，其他樣品均加入0.3 g氯化鈉，渦旋振蕩5 s，溶解混勻后放入SPE小柱，靜置10 min后，采用正己烷進行淋洗，之后采用乙醚-乙酸乙酯進行洗脫處理，收集到的洗脫液于40 ℃以下采用氮吹儀吹至近干，并用甲醇定容，制備成供試液。

固體及半固體基質：樣品絞碎后稱取1 g放入10 mL試管中，加入25 μL 10 μg·mL-1內標中間液，渦旋振蕩5 s后，加入0.5 g氯化鈉、1.5 mL乙腈和0.5 mL超純水，渦旋振蕩120 s后，3000 r·min-1離心15 min，取1 mL上清液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.4 儀器條件

（1）色譜條件。毛細管色譜柱，DB-INNOWAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進出口溫度：190 ℃；載氣：高純氮氣；進樣方式：脈沖不分流，0.9 mL·min-1的恒流模式；進樣量：1 μL；柱溫：50 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升溫至150 ℃保持2 min，再以30 ℃·min-1升溫至250 ℃保持5 min。

（2）質譜條件。電離方式：電子轟擊電離；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；監測方式：多反應監測方式；溶液延遲：5 min。

2 結果與分析

2.1 碰撞能優化

采用單四極桿質譜獲取到EC的特征粒子包括m/z44、m/z62、m/z74、m/z89，實際樣品處理后進樣，最終選取豐度大且干擾小的m/z62作為母離子，開展碰撞能優化實驗。取一定量的標準溶液，分別在10～40 eV（每10 eV設定一個等級）的不同碰撞能下進樣，結果如表1所示。在20 eV碰撞能下可以獲取最大豐度，子離子分別為m/z44、m/z44.9，豐度比為100∶33.5。

表1 碰撞能實驗

2.2 方法學評價

2.2.1 線性關系、檢出限與定量限

分別以對照品濃度與對應峰面積為橫縱坐標，進行線性回歸，獲得的標曲回歸方程為y=0.0078x-0.0239，相關系數R2=0.9999，接近于1，線性關系良好。

分別以3倍信噪比和10信噪比為基準，進行化合物檢出限與定量限測定，得到EC檢出限為3 ng·mL-1，定量限為10 ng·mL-1。

2.2.2 穩定性

將制備好的供試品溶液在室溫內進行首次測定，之后分別在2 h、4 h、12 h、24 h、48 h進樣測定，并記錄相應的EC峰面積，通過EC峰面積的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）大小反映測定結果的準確性。測定結果顯示，不同時間段下EC峰面積的相對標準偏差為1.57%，小于國際聯合委員會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）提出的峰面積相對標準偏差應＜2.0%的要求，說明供試品在48 h內始終保持穩定狀態。

2.2.3 加標回收試驗結果

精密稱取已測定含量的樣品，加入內標中間液（液體基質100 μL，固體基質500 μL），制備加標回收率測定樣品溶液，針對液體基質（料酒）和固體基質（面包）進行加標回收實驗，結果見表2。可以看出，液體基質與固體基質的平均回收率分別為100.17%、100.23%，相對標準偏差均小于5%，說明方法準確可靠。

表2 EC在液體基質和固體基質中的加標回收率

2.3 實際樣品的測定

采用本文建立的方法對市售白酒、料酒、醬油、醋、腐乳、發酵乳、豆豉和面包8種發酵食品中的EC含量進行測定，每種發酵食品各10份，測定結果取平均值。如表3所示，市售發酵食品中EC的平均含量為3.44～84.63 ng·g-1。在各類市售發酵食品中，腐乳中的EC平均含量最高，為84.63 ng·g-1，且檢測出的最高EC含量達到了246.82 ng·g-1，檢出率達到了100.00%。在日常飲食中，可將腐乳作為風味調味品使用，但不宜過多食用，以避免其對人體造成傷害。酒類發酵食品中EC平均含量也較高，白酒與料酒中的EC平均含量分別為48.24 ng·g-1與20.87 ng·g-1，檢出率均達到了100.00%。且白酒中的EC含量相對更高，考慮到白酒的度數較高，日常飲食中一般不會出現過度飲用的現象，且EC處于酒類國際安全限量標準以內，對人體幾乎不會造成傷害[5]。而料酒的主要功能是調味，其含量與醬油、醋等日常家用調味品相近，過多食用的概率較小，整體較為安全。豆豉、發酵乳、面包等發酵食品中的EC平均含量均處于較低水平，檢出率相對較低。綜上，本文選取的市售發酵食品中的EC含量整體處于合理范圍，食用量大的發酵食品EC含量較低，而EC含量較高的發酵食品多為調味品或食用量較小的白酒飲品，整體安全性可以得到保障。

表3 市售發酵食品中EC含量的測定結果

3 結論

EC污染是近些年食品領域面臨的主要安全問題。本研究提出了將GC-MS/MS法應用到發酵食品中EC含量的測定工作中，通過方法學評價驗證了該方法在測定發酵食品中EC含量的有效性。同時，采用GC-MS/MS法對8類市售發酵食品中的EC含量進行測定，測定結果顯示，各類發酵食品均有一定量的EC，以腐乳EC含量最高，豆豉、發酵乳、面包的EC含量低，整體表現出食用量與EC含量呈現反比的關系，即食用量大的豆豉、發酵乳、面包EC含量相對較低，而食用量較小，往往作為調味品的腐乳、白酒與日用調味品的EC含量相對較高，說明國內市售發酵食品的EC含量處于合理范圍，整體安全性較高。