高效液相色譜法同時(shí)測定醬油中7種防腐劑

黃 程，王婷婷

（武漢商學(xué)院 食品科技學(xué)院，湖北武漢 430056）

防腐劑能抑制微生物活動(dòng)，防止食品腐敗變質(zhì)，是一類十分重要的食品添加劑[1]。苯甲酸因其價(jià)格低廉，在我國食品生產(chǎn)中使用較為普遍[2]。山梨酸由于防腐效果穩(wěn)定，且與一般食品中的成分不發(fā)生作用，不會(huì)對食品風(fēng)味產(chǎn)生不良影響，所以在食品工業(yè)中應(yīng)用較為廣泛[3]。納他霉素能抑制酵母和霉菌生長，對于容易被霉菌污染的食品具有良好的防霉效果[4]。對羥基苯甲酸酯類防腐劑主要用于食品、動(dòng)物飼料以及化妝品中殺菌防腐，具有優(yōu)良的生物降解性能[5]。

防腐劑可以延長食品的保質(zhì)期，但長時(shí)間過量使用可能會(huì)對人體健康產(chǎn)生不良影響。研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸鈉多次給藥對大鼠肝腎有一定的損害[6-8]；人體過量攝入苯甲酸、山梨酸等食品添加劑，可能對人體外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性和遺傳毒性[9]；對羥基苯甲酸酯類具有雌激素活性，可能會(huì)對消費(fèi)者的健康產(chǎn)生一定的影響[10-11]，我國已禁止在食品中使用羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯。因此，加強(qiáng)食品防腐劑的監(jiān)測對保證食品安全具有重要意義。

目前，檢測食品中防腐劑的方法有液相色譜法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]、氣相色譜法[17-18]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-21]等。相較于氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用方法，液相色譜方法的適用性更為廣泛，前處理更為簡單，大多不需要經(jīng)過復(fù)雜的萃取、衍生化等步驟，是目前較為常用的檢測方法。根據(jù)我國現(xiàn)行有效的檢測方法，苯甲酸、山梨酸、納他霉素主要采用液相色譜法[22-23]，對羥基苯甲酸酯類則采用氣相色譜法檢測[24]。對同一樣品，同時(shí)測定這7種防腐劑，需要分開進(jìn)行，檢測效率低，且食品生產(chǎn)過程中涉及的原料、基質(zhì)復(fù)雜多變，添加的防腐劑種類也較多，因此建立一種同時(shí)測定多種防腐劑的方法對其質(zhì)量控制和保障食品安全具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸（99.66%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）、山梨酸（99.18%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）、納他霉素（1000 mg·L-1，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）、4種對羥基苯甲酸酯類（1000 mg·L-1，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）。甲醇（色譜級，德國默克股份兩合公司）、乙腈（色譜級，德國默克股份兩合公司）、乙酸銨（優(yōu)級純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、亞鐵氰化鉀（分析純，天津市百世化工有限公司）、乙酸鋅（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、乙酸（分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司）、蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。醬油購于本地超市。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀：美國Waters公司；TGL-205離心機(jī)：湖南平凡科技有限公司；QL-861渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-250B型超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；FA204電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別稱取適量的苯甲酸、山梨酸用甲醇溶解，配制成濃度為2.0 mg·mL-1的苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取配制好的苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與納他霉素、4種對羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用甲醇逐級稀釋成濃度為0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g醬油樣品于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，渦旋混合均勻，超聲提取15 min后，10000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，待用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液（B）；梯度洗脫：0～10 min，12%A；11～20 min，20%A；21～35 min，35%A；36～45 min，40%A；46～55 min，45%A；56～65 min，12%A；流速：1 mL·min-1；柱溫：35.0 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本文分別比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨和乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨4種不同流動(dòng)相體系對7種目標(biāo)化合物的分離度及峰型的影響，并調(diào)整有機(jī)相與水相的比例以達(dá)到最佳分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇-水、乙腈-水進(jìn)行洗脫時(shí)，羥基苯甲酸酯類無法完全分離，分離度較差。以甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨為流動(dòng)相洗脫時(shí)，由于流動(dòng)相中含有鹽類物質(zhì)，甲醇比例升高到一定程度后會(huì)導(dǎo)致色譜柱壓力過高，無法進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)最終選擇了乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。在該條件下，7種防腐劑可完全分離，色譜圖見圖1。

圖1 7種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（100 μg·mL-1）

2.2 提取溶劑的選擇

為了減少樣品中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的影響，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12,14,25-26]及國標(biāo)方法[23]，本實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇、乙腈、飽和氯化鈉-乙腈3種不同提取溶劑對7種防腐劑的提取效果。準(zhǔn)確稱取9份空白醬油樣品，每份2 g，置于50 mL的離心管中，分成3組，每組3個(gè)平行。向空白樣品中添加100 μg 7種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2方法進(jìn)行處理。其中，飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，先加入5 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋混勻后，再加入20 mL乙腈超聲提取。結(jié)果顯示，甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)，均有不溶性沉淀產(chǎn)生；飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，樣品中大部分物質(zhì)溶解在飽和氯化鈉溶液中，乙腈層較為清澈；3種提取方式均可在一定程度上達(dá)到去除雜質(zhì)的效果。比較3種提取溶劑的回收率可知（表1），3種提取溶劑對4種對羥基苯甲酸酯類的提取效果均較好，回收率可達(dá)101.8%～114.7%。但乙腈、飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，苯甲酸、山梨酸平均回收率較低，提取效果較差，這可能與苯甲酸、山梨酸微溶于水，導(dǎo)致部分滯留在水相中有關(guān)；且兩種提取方式中，雜質(zhì)峰對苯甲酸均存在干擾，無法完全分離。飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，苯甲酸幾乎被雜質(zhì)峰完全掩蓋，無法獲取峰面積信號。而甲醇作為提提溶劑時(shí)，色譜圖中雜質(zhì)峰相對較少，7種目標(biāo)物質(zhì)均不受雜質(zhì)峰的干擾，且都有較高的回收率，平均回收率在104.9%～114.5%。故選定甲醇作為提取溶劑。

表1 3種提取溶劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

2.3 線性范圍及檢出限

取1.3.1配制好的防腐劑的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制7種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)信噪比（S/N）=3計(jì)算檢出限，信噪比（S/N）=10計(jì)算定量限[27]。結(jié)果表明，7種防腐劑在0.2～100.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.998。檢出限為0.063～2.000 mg·kg-1，定量限為0.209～6.667 mg·kg-1，詳見表2。

表2 7種防腐劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 加標(biāo)回收率及精密度

準(zhǔn)確稱取18份空白醬油樣品，每份約2 g，分別添加（20 μg）、中（40 μg）、高（100 μg）3個(gè)水平的7種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2的處理方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，各組分的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。由表3可知，7種目標(biāo)化合物的平均回收率為96.05%～114.17%，RSD為0.02%～4.02%，方法的回收率和精密度良好，可作為醬油中7種防腐劑的檢測方法。

表3 7種防腐劑加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本實(shí)驗(yàn)方法分別對5批醬油樣品進(jìn)行處理，測定7種防腐劑的含量，結(jié)果如表4所示。5批次樣品中苯甲酸含量為0.471～0.856 g·kg-1，山梨酸含量為0.199～0.645 g·kg-1，均符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定。

表4 樣品的測定結(jié)果（n=3） 單位：g·kg-1

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜同時(shí)測定醬油中7種防腐劑的分析方法。該方法操作方便、簡單易行、準(zhǔn)確度和精密度較高，能夠滿足醬油中多種防腐劑的檢測需要，可為防腐劑的檢測和使用監(jiān)管提供參考。