UPLC-MS/MS法測定醬香型白酒原輔料中非揮發性酚酸

駱茂香，劉 磊，陳 雯，陳仁遠*

（1.貴州省酒類產品質量檢驗檢測院，貴州仁懷 564500；2.茅臺學院，貴州仁懷 564500）

酚酸是酚類化合物，是食品中主要抗氧化物質的來源，其組成及含量對抗氧化活性起著決定性作用[1]。非揮發性酚酸包括原兒茶酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等[2]。白酒釀造用原輔料如高粱、大曲中存在一些酚酸類物質，原輔料在各酶系、微生物的作用下也會生成一些酚酸，這些活性物質經過釀造、蒸餾等過程進入酒體，賦予白酒特殊的苦味和堅果香氣，不僅影響白酒的風格和口感，增加白酒風味層次感，同時還具有抗氧化的作用[3-5]。有研究報道，酚酸對冠心病、糖尿病、高血脂、痛風等都有一定的預防作用[6-10]。阿魏酸是一種抗氧化劑，也是防癌物質，具有抗炎鎮痛的功效[11]。因此，對白酒釀造原輔料中的酚酸進行定量有助于監控白酒的質量，提升白酒的品質。

目前，對酚酸進行檢測的方法主要有薄層色譜法[12]、氣相色譜-質譜聯用法[13]、液相色譜-串聯質譜法[14]等。酚酸類物質在醬香型白酒和其原輔料中含量較低，并且大多研究旨在檢測白酒中酚酸的含量，對白酒原輔料中酚酸含量的研究較少。因此，本研究采用液相色譜-串聯質譜法對白酒原輔料中的非揮發性酚酸進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仁懷醬香型白酒核心產區所用大曲、高粱；原兒茶酸（99.0%）、對香豆酸（99.7%）、綠原酸（98.9%）、咖啡酸（99.7%）、阿魏酸（99.9%），阿爾塔公司；甲醇（色譜純，德國默克公司）；磷酸（色譜純，科密歐公司）；超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

漩渦振蕩器（XH-B，江蘇天翎公司）；臺式電子天平（精確度0.0001 g，賽多利斯公司）；0.44 μm濾頭；離心機（TD4Z-WS，湖南湘立公司）；液相色譜質譜聯用儀（Thermo Ultimate 3000，美國賽默飛世爾科技公司）；超純水機（Milli-Q，Millipore公司）；電子天平（精度0.0001 g，賽多利斯公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

粉碎高粱、大曲后分別過40目、20目篩，參照趙尚碧等[15]的樣品預處理方法對樣品前處理條件進行優化。分別稱取5 g（精確至0.001 g）高粱或大曲粉末樣品于50 mL離心管中，加入50%甲醇水溶液20 mL，振蕩5 min后，以3000 r·min-1離心30 min，吸取0.200 mL上清液于50 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動相A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇，洗脫程序：0～15.00 min，5%→100% B，15.10～17.00 min，100% B，17.10～20.00 min，5% B；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.25 mL·min-1。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI），負離子模式；選擇反應監測模式（Selected Reaction Monitoring，SRM）；毛細管溫度：300 ℃；霧化氣溫度：320 ℃；鞘氣壓力：25 Arb；噴霧電壓：3500 V。5種酚酸的質譜分析參數見表1。

表1 5種酚酸的質譜分析參數

1.3.3 酚酸標準溶液的配制

標準溶液配制：分別取一定質量的5種酚酸標準品，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成一定濃度的標準儲備液，在-20 ℃冷凍保存。用甲醇稀釋標準儲備液，配制5種酚酸混合標準工作液，現配現用。標準溶液配制濃度見表2。

表2 標準溶液配制

1.3.4 數學模型

樣品中酚酸含量的計算公式為

式中：C為待測組分的含量，g·kg；C測為由標準曲線得出的待測物的質量濃度，μg·L-1；m為所稱取的樣品質量，g；V為定容體積，mL。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

對原兒茶酸、對香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸5種目標化合物標準工作溶液進行測定，并繪制標準曲線，結果如表3所示。原兒茶酸、對香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸的標準曲線相關系數均大于0.995，相關系數滿足《檢測和校準實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準實驗室能力認可準則在化學檢測領域的應用說明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規范性技術文件規定的對于確認方法相關系數不應低于0.99的要求。

表3 目標化合物標準曲線線性方程

2.2 精密度實驗

配制原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸在高粱和大曲中3個濃度水平的樣品添加溶液，分別進樣6次計算精密度。由表4可知，5種酚酸在高粱、大曲中的精密度試驗中變異系數為0.6%～6.3%，滿足《檢測和校準實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準實驗室能力認可準則在化學檢測領域的應用說明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規范性技術文件規定的精密度試驗中變異系數小于7.5%的要求。

表4 目標化合物檢測方法的精密度實驗結果

2.3 回收率及準確度實驗

在空白樣品中分別添加原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸標準溶液，在S1、S2、S53個濃度水平進行回收率和準確度試驗，每個濃度水平添加3個平行樣。由表5可知，在3個加標水平下，化合物的回收率在94.2%～108.1%，滿足《檢測和校準實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準實驗室能力認可準則在化學檢測領域的應用說明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規范性技術文件規定的回收率為90%～120%的要求。各樣品化合物在S1、S2、S53個空白加標濃度水平的準確度偏差在-5.8%～8.1%，滿足《檢測和校準實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準實驗室能力認可準則在化學檢測領域的應用說明》（CNAS-CL01-A002：2020）等規范性技術文件規定的準確度偏差在-20%～20%的要求。

表5 目標化合物回收率及準確度

2.4 實驗樣本測定

建立4種酚酸定性、定量方法后利用液相-串聯質譜儀對樣品進行檢測。樣品中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸的含量范圍如表6所示。

表6 樣品中5種酚酸的含量 單位：g·kg-1

3 結論

采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測醬香型白酒原輔料（高粱和大曲）中的5種酚酸（原兒茶酸、對香豆酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸）含量，方法操作簡單、可靠，R2值、RSD、加標回收率、準確度等各項指標均達到分析要求，可用于醬香型白酒原輔料中酚酸含量的測定，有助于監控白酒的質量，提升白酒的品質。