基于超高分辨率和超長深度光學相干層析成像技術的懸尾鼠航天相關神經眼綜合征研究*

陳思思 張 璽 鄭 谷 汪慶映 丁學雯 陳宇雷 舒咬根

1(國科溫州研究院 溫州生物材料與工程研究所 溫州 325001)

2(溫州醫科大學附屬眼視光學院 溫州 325027)

3(國家藥監局疫苗及生物制品質量監測與評價重點實驗室 溫州 325001)

4(甌江實驗室（再生調控與眼腦健康浙江省實驗室） 溫州 325024)

0 引言

美國國家航空航天局（NASA）研究發現，執行短期和長期任務的航天員分別有29%和60%出現了遠視和近視敏銳度下降的癥狀，其中在太空駐留6個月以上的航天員還患上了不可逆轉的視覺障礙[1-3]。其癥狀表現為視盤水腫、脈絡膜增厚、棉絮斑和遠視移位等，統稱為航天相關神經眼綜合征（Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome，SANS）[3-5]。視覺障礙影響人類85%的信息獲取，因此是航天員面臨的最大健康風險，也是未來移民外星計劃的最大挑戰。目前普遍認可的SANS發病機制是長期失重導致顱內高壓的假說[6-10]，但是關于SANS與失重之間的分子機制尚未被揭示。由于在中國空間站直接進行動物實驗的條件還不成熟，且成本太高，因此建立地面可行的SANS研究模型對于進一步探索疾病的發病機制和尋找有效的臨床治療方案是目前比較經濟可行的替代措施[11]。

2016—2021年中國先后開展了地面懸尾鼠的實驗研究[12-17]，懸尾時間從幾天到12周不等。實驗結果表明，鼠懸尾時間越長，視力損失越明顯。初期僅觀察到血流速度降低，無視網膜厚度改變；8周后眼底可見視網膜外核層厚度變薄，脈絡膜血管增多；12周后則可見視網膜軸突超微結構改變和細胞凋亡等。上述地面懸尾鼠模型可以模擬出失重鼠眼部輕微損傷，但尚未模擬出SANS的臨床或亞臨床癥狀，這可能與懸尾時間短、成像技術差及視盤部位測量缺失有關，因此有研究提出應重視視盤部位變化的監測[18]。

近期快速發展起來的光學相干斷層掃描技術（Optical Coherence Tomography，OCT）因其超高的分辨率和無創的檢查手段而優于傳統病理學切片，可以彌補上述技術缺失。OCT使用低相干光源對組織進行斷層掃描，形成光學切片，通過量化從組織反射至探測器的光波強度，可以測量組織不同層次的深度信息，因而在眼神經疾病中有較高的輔助診斷價值[19]。本研究選用自行構建的OCT，對懸尾鼠進行在體眼球特征參數測量，前期工作[20,21]證明此方法具有較高的重復性和便捷性。

NASA也使用OCT對航天員進行眼部檢查，對比飛行前后的眼部數據發現，視神經增厚常伴隨視盤水腫的癥狀，并且早于后者[2]，即視盤水腫的亞臨床期為視神經層增厚。為此，本文利用構建的OCT系統對較長期懸尾鼠的眼部特征參數進行觀測，為建立經濟可行的SANS動物模型提供在體眼部特征參數測量及評估的新方法。

1 材料與方法

1.1 動物

1.1.1 分組

實驗采用SPF級雄性Sprague Dawley大鼠18只，體重為220～240 g。所有動物均在標準實驗室條件（溫度：18～23 ℃；濕度：40%～65%）下飼養，并在環境光照強度為15 lx的條件下進行12 h的明暗調節。將18只大鼠隨機分為基礎對照組、對照一個月組和懸尾一個月組，每組各6只。所有大鼠均在相同環境條件下適應性飼養一周后再開始分組實驗（計時開始），第0天測量所有大鼠的體重及眼部特征參數，并記作兩組大鼠共同的基線數值。一周內進行兩次隨訪，分別于第0, 3, 8, 10, 13, 18, 24, 27天測量大鼠體重。在實驗第27天使用戊巴比妥鈉和甲苯噻嗪麻醉大鼠，再用托吡卡胺散瞳后測量大鼠眼部和眼底亞層參數。本研究遵照視覺與眼科研究協會（ARVO）“關于在研究中使用動物的聲明”進行實驗。所有程序均經溫州醫科大學實驗室機構動物護理和使用委員會及國科溫州研究院機構動物護理和使用委員會批準（倫理批件號：wydw2022-0191，WIUCAS 22040701）。

1.1.2 微重力大鼠模型

采用懸尾法模擬大鼠失重，構建SANS模型[22]（見圖1），懸尾組的大鼠被單籠飼養，對照組與實驗組的則采用相同實驗條件飼養。所有大鼠適應性飼養一周后，首先將實驗組大鼠尾巴用75%醫用酒精棉片消毒，將兩條長約20 cm、寬約1 cm的醫用膠帶沿大鼠尾巴縱向固定，兩條膠帶的中間空余部分不與皮膚接觸。將尾巴用醫用紗布包裹以保護皮膚并加固。膠帶近端距離大鼠尾巴根部約2 cm，中間緊貼大鼠尾巴，遠端超出部分懸掛固定于特制的鼠籠頂部，保持鼠尾部懸吊，后肢懸空，前肢部分接觸地面，但尚不足以減輕頭部及上肢所需承受的全身重量。懸尾期間保持大鼠處于頭低位，身體縱軸與水平線呈-30°夾角。大鼠前肢可在水平面360°自由移動。實驗期間保持飼料和水源充足，所有大鼠可自由飲水和進食。

圖1 大鼠懸尾模型實驗Fig.1 Diagram of rat tail suspension

1.2 儀器

1.2.1 視網膜眼底照相

采用Phoenix Micron IV小動物視網膜顯微成像系統對大鼠進行在體視網膜形態檢查。首先將大鼠麻醉以保持相對固視狀態，然后在大鼠雙眼中滴復方托吡卡胺滴眼液以散瞳，增大拍攝范圍，再涂甲基纖維素眼用凝膠于大鼠角膜表面，使凝膠作為透明屈光介質位于角膜和鏡頭之間。接下來將大鼠平放于動物臺上，調整系統儀器位置，使眼底視盤中心、角膜頂點、顯示器注視點位于同一水平。若在觀察過程中出現視野不全或離焦，及時微調試驗臺各組件的位置。如圖2（a）所示，調整鏡頭焦距至大鼠眼底清晰可見時即可拍攝眼底圖像。眼底內科臨床醫生根據保存的所有眼底圖像判斷視盤水腫癥狀是否存在。

圖2 大鼠眼成像及分析。（a）大鼠眼底彩照，OD表示右眼，（b）大鼠超長深度OCT全眼成像，（c）大鼠超高分辨率OCT眼底成像及分層界限和層次定義。白色豎線為200 μm標尺Fig.2 Schematic representation of rat ocular imaging and analysis.(a) Rat fundus color photograph (OD represents the right eye), (b) rat ultra-long depth OCT imaging of the entire eye, (c) rat high-resolution OCT fundus imaging with layer boundaries and definitions, with the white vertical line representing a 200 μm scale

1.2.2 超長深度光學相干斷層掃描

采用超長深度光學相干斷層掃描（Ultra-Long Optical Coherence Tomography, ULOCT。中心波長840 nm，帶寬45 nm，軸向分辨率10 μm，成像深度7.20 mm）測量大鼠眼部相關特征參數。OCT掃描的樣品臂和探頭部分安裝了二維掃描振鏡，即“十字掃描對準”，可與探頭在鼠眼上同時進行移動，確保OCT探頭對準鼠眼而無偏斜。掃描前需確認OCT圖像在水平方向和垂直方向同時存在角膜頂點鏡面反光，且虹膜盡量處于水平。OCT使用固定參考鏡，通過部分干涉原理顯示相對于參考鏡的光反射表面的位置。光譜儀測量的干涉信號由高速相機通過數據采集卡采集，再經傅里葉變換得到剖面深度信息。大鼠的眼軸比小鼠的長，測量小鼠眼軸的OCT裝置由于硬件限制無法對大鼠眼軸完整成像，因此將參考臂長設置在晶狀體的中間位置附近，大鼠眼部的一半會以鏡像形式成像，使得大鼠眼部的前段和后段在同一窗口內以重疊的形式顯示，這種方法被證明是有效的[23]。每次掃描形成的二維圖像為2048×2048 pixel，經過Matlab 2010 a自編軟件處理，分別探測到角膜上下邊界L1和L2、晶狀體上下邊界L3和L4、視網膜色素層邊界L5，其中角膜厚度CT定義為L2-L1、前房深度ACD定義為L3-L2，晶狀體厚度LT定義為L4-L3，玻璃體腔深度VCD定義為L5-L4，眼軸長度AL定義為L5-L1，如圖2（b）所示。

1.2.3 視網膜超高分辨率光學相干斷層掃描

采用視網膜超高分辨率光學相干斷層掃描（Ultra-High Resolution Optical Coherence Tomography，UHROCT。中心波長850 nm，帶寬100 nm，軸向分辨率3.1 μm，成像深度1.98 mm）測量大鼠眼底亞層結構參數。為便于實時進行眼底亞層定位，OCT樣品臂同時加裝一共軸攝像機，將視盤部位調整至圖像中間后再采集數據。為便于觀測視網膜亞層結構，在OCT上裝配60 D（D為屈光度單位）的目鏡，將大鼠視神經細胞層和神經纖維層定義為神經節層；將視網膜外核層內界至神經節層外界之間的視網膜組織定義為視網膜內層，將外核層內界至脈絡膜內界之間的視網膜組織定義為視網膜外層。每次掃描形成的視盤部位（ONH）眼底二維圖像像素為2048×2048 pixel，數據經過Matlab 2010 a自編軟件處理后分別得到神經節層、視網膜內層、視網膜外層、脈絡膜和鞏膜等的厚度，如圖2（c）所示。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。大鼠體重參數使用重復測量方差分析。眼部特征參數呈正態分布的計量資料以x±s表示。各組數據符合正態分布且方差齊，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以p＜0.05 為差異顯著,p＜0.01 為差異極顯著。

2 結果

2.1 體重變化數據

關于懸尾實驗組（suspended）與非懸尾對照組（control）的大鼠體重變化，實驗前第0天兩組大鼠體重變化無統計學差異（p＞0.05），第3, 8, 10, 13天懸尾實驗組和非懸尾對照組大鼠體重存在統計學差異（第3天p＜0.05，其余p＜0.01），前者的體重比后者輕，但在第18, 24, 27天所測兩組體重無統計學差異（p＞0.05）（詳見圖3）。數據顯示第18天后，二者的體重無統計差異。懸尾期間大鼠的體重增長率是反映其應激程度的總體指標，因此體重的長期穩定增長表明本實驗引起的應激較小。

圖3 大鼠體重隨懸尾天數的變化統計（統計數量n=6。數據顯示第18天后二者的體重無統計差異）Fig.3 Statistical rat body weight over the duration of tail suspension（The data indicated that there were no statistically significant differences in body weight between the two groups after the 18th day, the number of statistical samples for each group n is equal to 6）

2.2 大鼠視網膜眼底彩照未出現視盤水腫癥狀

經眼底內科臨床醫生評估，所有大鼠雙眼眼底彩照都為正常眼底，均未出現明顯的視盤水腫癥狀及其他異常。如圖2（a）所示，眼底彩照中大鼠視網膜呈橘紅色，圓形視乳頭呈淡紅色，二者邊界清，無異常隆起，視網膜血管從視盤中央通過。視網膜血管走形正常，無明顯迂曲擴張，未見出血點及滲出病灶。

2.3 大鼠ULOCT眼部特征參數顯示懸尾后眼軸明顯縮短

圖4給出大鼠眼部特征參數及眼底亞層結構參數統計分析結果，從圖4（a）可以看出，與第0天測得的大鼠眼部baseline特征參數比較，非懸尾對照組一個月后對應的特征參數變化情況為：角膜厚度（CT）增加，前房深度（ACD）增加，晶狀體厚度（LT）增大，玻璃體腔深度（VCD）增加，眼軸長度（AL）增加，除VCD外，其余均有明顯統計學差異（p＜0.01）；懸尾一月后實驗組對應的特征參數變化情況為：角膜厚度（CT）減小，前房深度（ACD）增加，晶狀體厚度（LT）增加，玻璃體腔深度（VCD）減小，眼軸長度（AL）增加，除CT外，其余均有明顯統計學差異（p＜0.05 ）。重要的是懸尾一個月后實驗組與非懸尾組特征參數的比較，研究發現大鼠角膜明顯變?。╬＜0.01），眼軸縮短（p＜0.05），其他參數則無明顯統計學差異（p＞0.05）。

圖4 大鼠眼部特征參數（a）及眼底亞層結構參數統計分析（b）。數據表明懸尾一個月后，眼軸明顯縮短且視網膜外層厚度顯著下降Fig.4 Statistical graph of rat ocular feature parameters (a) and sublayer parameters of the fundus (b).The data indicated that after suspension of one month there was a significant decrease in axial length and outer retina thickness

2.4 UHROCT眼底亞層特征參數顯示視網膜外層厚度顯著下降

分別在實驗第0天和一個月后測量大鼠眼底亞層特征參數，包括視神經層（RNFL-GCL）、視網膜內層（Inner Retina）、視網膜外層（Outer Retina）、脈絡膜（Choroid）、鞏膜（Sclera）。根據圖4（b）的統計分析結果，懸尾一月后實驗組與非懸尾對照組相比，視網膜外層厚度顯著下降，差異有統計學意義（p＜0.05）。非懸尾對照組與第0天基線值相比，視網膜內層厚度變薄，有顯著統計學差異（p＜0.01）。其余無統計學差異（p＞0.05）。其中在視神經層中，盡管統計學上未有顯著性差異，但實驗發現懸尾鼠組在一個月后的視神經層厚度為29.91±8.63 μm，對照組一個月后為26.29±10.53 μm，基礎組為27.12±8.44 μm，表明懸尾組的視神經層厚度有輕微增厚趨勢。

3 討論

根據長期失重動物實驗的模擬要求[22,24]，通過體重監測可以保障微重力大鼠模型實驗的成功。圖1數據顯示，短期懸尾處理對大鼠生長發育存在影響，但長期（18天后）懸尾處理對體重無明顯影響。研究結果表明本文采用的長期懸尾對大鼠的生長發育應激影響較小。

基于自行構建的OCT 系統對懸尾鼠眼部特征參數（角膜厚度、前房深度、晶狀體厚度、玻璃體腔深度、眼軸長度以及眼底亞層）進行在體成像及定量分析，同時對懸尾鼠眼底彩照也做了定性分析。通過隨訪觀察各眼部特征參數，成功建立了地面模擬失重的動物模型，發現SANS亞臨床前期的眼部癥狀，例如眼軸明顯縮短[2]。因此，通過長期懸尾處理以及適當的監測即可成功建立SANS動物模型，為后期研究SANS的發病機制和治療手段提供依據。

本研究使用的是無創在體檢測手段，在未處死實驗動物的前提下即可檢測到SANS癥狀，避免經常解剖實驗組離體鼠眼導致的非自身對照偏差，并為后續在體動物實驗保留了寶貴的模式動物。

國際空間站自建立以來已經開展多次空間小鼠實驗。2013—2020年間，美國加利福尼亞州的Mao和Roque-Torres團隊[25-29]（Loma Linda University）對空間小鼠眼部變化進行了離體研究。實驗在小鼠麻醉后摘取了眼球，通過TUNEL免疫細胞化學分析，與地面對照組比對后發現，航天飛行誘導了小鼠視網膜細胞（尤其是視神經節細胞）的顯著凋亡[25,28]。通過蛋白測定，發現參與血管滲透屏障的水通道蛋白AQP4的表達量顯著增加[26]。最近，其采用Micro-CT 對離體鼠眼進行結構測定，發現空間組小鼠眼睛發生了結構變化，尤其是視網膜、色素層和脈絡膜層的厚度明顯降低[30]。但是這些發現離SANS癥狀的直接證據較遠。 2016—2021年 Zhao 等[13]、Dai等[14]和Gong等[15,16]開展了地面懸尾鼠的實驗研究，將實驗鼠分別懸尾1天、4天、7天、14天、30天和12周不等，在各時間節點檢測實驗鼠眼部特征參數。研究結果表明：使用彩色多普勒超聲診斷儀檢測眼軸和視網膜中央動脈血流速度發現：懸尾第一天血流速度加快，但7天內血流速度下降，懸尾14天后血流速度部分回升，但眼底彩照未見視盤水腫、出血、視網膜出血、滲出等癥狀；使用商用OCT 測量距離視盤水平顳側2個視盤直徑處的視網膜、脈絡膜厚度發現，懸尾1天、4天、7天、14天、30天、4周視網膜厚度均無顯著變化，8周內核層變薄，伊紅染色表現為退行性病變；懸尾14天、8周脈絡膜厚度仍無顯著變化；使用OCT、熒光造影檢測視乳頭直徑、視網膜厚度、視網膜大血管直徑，發現視網膜大血管管徑在懸尾30天內增加，解除懸尾處理后管徑恢復，視乳頭直徑無明顯變化；使用閃光眼電圖和視覺誘發電位檢測視覺功能發現，懸尾8周視覺功能較正常水平下降，表現為眼電圖的OPs波反應幅值降低，懸尾12周視覺功能顯著下降，表現為神經節細胞數量減少，視神經損傷，軸突密度降低。但是這些研究均未檢測到典型的SANS癥狀，例如遠視移位對應的眼軸縮短、視盤水腫和脈絡膜充血增厚等。

由于大鼠眼軸較小鼠更長，因此自行構建了改進的OCT進行測量，研究發現視神經厚度改變前發生了明顯的眼軸縮短癥狀，與SANS的遠視移位癥狀吻合。定量分析結果發現，懸尾1月后發現眼軸縮短約100 μm，角膜厚度變薄13 μm。據此可以推測SANS的發生發展過程：首發癥狀為眼軸縮短，導致遠視移位，同時伴有視網膜外層改變和角膜厚度變薄等癥狀；其次為視神經層水腫導致的厚度改變，并進展為視盤部位水腫；最終引發SANS的其他如棉絮斑、球后極部扁平和脈絡膜皺褶增厚等遠期癥狀。

此外，基礎組與對照組的統計數據表明：除視網膜內層變薄以外，所有參數均無統計學差異。該結果與其他團隊長期觀察正常對照組大鼠的眼底亞層結構變化趨勢一致[31]。眼部形態參數中，除玻璃體腔深度之外，其他參數均有顯著增大，表明鼠眼球形態可在一個月后發生顯著發育增長，與離體冷凍切片研究小鼠眼球形態發育的結果基本一致。此外，角膜厚度、晶狀體厚度和眼軸均增長[32]。

本文實驗沒有發現SANS最典型的視盤水腫癥狀，只發現了SANS的亞臨床前期癥狀，這可能與懸尾時間較短有關。為此，將繼續開展更長時間的懸尾實驗研究，以期觀察到完整的SANS癥狀。由于大鼠的飼養環境為SPF屏障環境，即取出測量后無法再返回屏障環境，因而本實驗無法對大鼠進行長期的自身對照研究。后續會對動物房進行改擴建，以容納大型的眼科設備，便于開展觀察節點更為密集的研究，對眼部各癥狀發生發展的分子機制[33]開展進一步探索。此外，大鼠的尾部懸吊材料和方式也需要進一步優化，減少其對皮膚的刺激，滿足更長期懸尾實驗的要求。

盡管目前研究均未提出SANS的分子機制，本文根據現有的研究成果提出了TRPV4（Transient Receptor Potential IV）通道和視盤水腫的分子假說：TRPV4是力（例如壓力和滲透壓）致敏感型瞬時受體電位IV型離子通道，外界壓力的改變會使通道失控，最終導致膜電位異常[34-36]。TRPV4通常與水通道蛋白AQP4（Aquaporin）偶聯，后者又與多個水腫過程密切相關[34,37]，是治療腦脊液流體動力學受損和顱內壓升高的神經疾病的潛在靶點。研究發現視網膜上的視神經細胞膜表面分布了大量TRPV4通道[37]，由此可以推斷視盤水腫與TRPV4通道異常密切相關。因此可以提出假說：失重造成的顱內壓與眼壓的反差導致了TRPV4與AQP4的偶聯異常，最終誘發不可逆的SANS，后續SANS的癥狀是其繼發的臨床表現。本文研究為揭示微觀層面的分子機制提供了宏觀的動物模型以及觀測方法。

4 結論

研究建立了航天相關神經眼綜合征（SANS）的動物模型，基于自行構建的ULOCT和UHROCT平臺提出了在體眼部測量及評估的新方法。這些新設備和新方法具有更高的精度和穩定性。因此可以發現SANS亞臨床期的眼軸長度和眼底亞層厚度發生的細微變化，而傳統的眼底彩照技術不能及時觀察到這些細微變化。本研究為后續開展微觀層面的SANS分子機制研究提供了宏觀的動物模型以及在體眼部測量新方法，同時希望盡早與空間站實驗鼠的數據進行比對，進一步完善SANS的實驗和理論研究。