金水六君煎對慢性阻塞性肺疾病小鼠模型巨噬細胞M1/M2表型分化的影響*

楊億然，張 真，劉 雨

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是臨床常見的呼吸系統疾病，以不可逆的氣流受限為主要特征，臨床表現為咳嗽、咳痰及呼吸困難等[1]。COPD與吸煙、呼吸道感染和空氣污染等因素密切相關。炎癥是COPD發生發展的重要機制，預防和控制肺部炎癥的發生是改善COPD患者癥狀的重要方法[2-4]。肺部炎癥與巨噬細胞密切相關，主要包括經典激活的巨噬細胞（巨噬細胞M1極化）和替代活化的巨噬細胞（巨噬細胞M2極化）兩種活化方向。M1極化以釋放炎癥因子、促進炎癥發展為主，M2極化以釋放抑炎因子、抑制炎癥發展為主。因此，明確COPD中巨噬細胞的極化方向有重要意義[5-8]。金水六君煎出自《景岳全書》，具有養陰化痰之功效?，F有研究表明，金水六君煎對COPD有著良好的治療作用。無論是COPD緩解期還是急性加重期，在常規治療的基礎上加用金水六君煎，能有效縮短病程，改善患者癥狀，減少病情惡化的發生率[9]。研究認為其機制可能與抑制炎癥因子高表達有關[10]。因此，本研究以COPD小鼠為研究對象，觀察金水六君煎對巨噬細胞極化方向的影響，以闡明金水六君煎治療COPD的可能機制及靶點。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF級雄性ICR小鼠32只，6～8周齡，體質量（16.91±1.24）g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，實驗動物質量合格證號：110322211101433345，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0008。本實驗經湖南中醫藥大學動物實驗中心審核通過，動物實驗倫理批號：LL2022022305。小鼠飼養于12 h黑夜、12 h白晝的環境中，飼養室溫度為22～24 ℃，相對濕度為50%～60%。飼養期間小鼠自由進食和飲水。

1.2 香煙 金圣牌香煙，江西中煙工業有限責任公司生產，焦油含量8 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，CO含量9 mg。

1.3 實驗試劑 PBS（批號：04B230203）購自長沙艾碧維生物科技有限公司；CD86抗體（PE）（批號：02S230111）、CD163抗體（APC）（批號：20210727003）、CD206抗體（FITC）（批號：00113481）均購自安諾倫生物科技有限公司；CD68抗體（PC5.5）（批號：00109616）購自百進生物科技有限公司；石蠟（批號：20213642012）、中性樹膠（批號：20211031020）購自上海西格瑪有限公司；蘇木素（批號：20210301006）、PBS（批號：20210618005）、伊紅（批號：20211130004）購自美國薇碧生化科技集團公司；白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（批號：07D21228）、白介素-8（IL-8）ELISA試劑盒（批號：03C20216）、CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG（H+L）（批號：13A2030004）、CoraLite594-conjugated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（批號：10S22110）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；甲潑尼龍片（批號：13A221229）購自意大利輝瑞制藥廠。

1.4 實驗儀器 SL02型低速離心機購自上海知信實驗儀器；A00-1-1102型流式儀購自貝克曼庫爾特有限公司；H1650R型臺式高速冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；PW-812型全自動酶標洗板機、MB-530型多功能酶標分析儀均購自深圳市匯松科技發展有限公司；DHP-500型電熱恒溫培養箱購自北京市永光明醫療儀器有限公司；TS-92型搖床購自其林貝爾；DYY-6C型恒溫箱購自北京六一生物科技有限公司；MM721 AAU-PW型微波爐購自美的集團有限公司；M199型切片刀購自德國徠卡公司；YD-315型切片機購自浙江金華益迪試驗器材；BMJ-A型包埋機購自常州中威電子儀器有限公司；BCD-245F型普通冰箱購自合肥榮事達電子電器集團有限公司；E-201-C型精密pH計購自上海雷磁環保工程有限公司；BA210T型顯微鏡購自麥克奧迪有限公司；DY89-1型蓋玻片、AY89-2型載玻片均購自海門遠泰實驗器材廠。

1.5 藥物配制 金水六君煎藥物組成參照《景岳全書》原方[11]：當歸6 g，熟地黃15 g，陳皮4.5 g，法半夏6 g，茯苓6 g，炙甘草3 g，生姜10 g。以上各藥均為新綠藥配方顆粒，購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院，經田其學主任藥師鑒定確認為正品。將上述藥物用適量的滅菌水配置成生藥質量濃度為1 g/mL的藥液，現配現用。

2 實驗方法

2.1 模型制造 將小鼠放置于熏煙箱（1.6 m×0.5 m×0.25 m），箱體設有通風口，防止小鼠窒息死亡。通風口對接煙霧處理設備，防止煙霧逸出污染環境。將20根香煙點燃后并放入熏煙箱內，持續熏煙1 h，中途休息15 min，重復上述步驟再次熏煙1 h，1次/d，2 h/次，連續12周。

2.2 實驗分組 將32只ICR小鼠隨機分為空白組、模型組、西藥組和中藥組，每組8只。小鼠給藥劑量參考人和動物表面積折算的等效劑量比率表，中藥組給藥劑量為6.565 g/（kg·d），西藥組經人體劑量換算后予甲潑尼龍，4.16 mg/（kg·d）[12]，空白組和模型組小鼠予等量生理鹽水灌胃，6.57 mL/（kg·d）。除空白組外，各組小鼠均在第1周起接受煙熏，第5周開始在熏煙前1 h灌胃相應藥物?？瞻捉M小鼠只灌胃，不做熏煙處理。

2.3 觀察指標

2.3.1 肺功能檢測 12周后腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉小鼠后，分離暴露氣管，進行氣管插管固定，使用小動物肺功能檢測儀測定每分鐘通氣量（MV）、吸氣峰流量（PIF）及呼氣峰流量（PEF）。

2.3.2 肺組織病理 HE染色觀察肺組織病理。12周后處死小鼠，取小鼠肺部組織浸入4%多聚甲醛內固定24 h。60 ℃烤片12 h，切片脫蠟至水，經蘇木素、伊紅染色后，梯度酒精脫水。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并采集圖像。

2.3.3 肺組織IL-6和IL-8水平 取一定量肺組織，制備10%肺組織勻漿液，4 ℃，1 000 r/min離心10 min（離心半徑為7 cm），取上清液，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測IL-6、IL-8水平。

2.3.4 肺組織CD68和CD206表達 采用免疫熒光觀察小鼠肺組織CD68和CD206表達。取小鼠肺部組織浸入4%多聚甲醛內固定24 h。60 ℃烤片12 h，切片脫蠟至水，熱修復抗原，經過硼氫化鈉溶液、乙醇溶液、蘇丹黑染液處理后，于10%正常血清/5%BSA封閉60 min。孵育一抗：滴加適當稀釋的一抗（CD68+CD206），4 ℃過夜。PBS沖洗3次，5 min/次。孵育二抗：滴加50～100 μL抗-小鼠+兔-IgG標記熒光抗體，37 ℃孵育60～90 min，PBS沖洗3次，5 min/次。DAPI工作液染核后PBS充分沖洗后取出。熒光顯微鏡下觀察，熒光顯微鏡電腦采集圖像。

2.3.5 巨噬細胞M1和M2極化情況 采用流式細胞儀檢測巨噬細胞M1和M2極化情況。取小鼠肺組織冷凍于液氮內，并用膠原酶I配制成0.2 mg/mL的消化液，組織剪碎后轉移至15 mL離心管，加入6 mL消化液，充分消化后加入6 mL DMEM終止消化。使用細胞濾網過濾，剩余組織研磨后，DMEM沖洗過濾網。4 ℃，1 000 r/min離心5 min（離心半徑為7 cm），棄去上清液，收集細胞懸液后再次4 ℃，1 000 r/min離心5 min（離心半徑為7 cm），收集細胞沉淀。加入CD86和CD163抗體，孵育。設置陰性管，單染管。4 ℃，1 000 r/min離心5 min（離心半徑為7 cm），破膜、洗滌，加入CD86和CD206抗體，孵育。設置單染管，洗滌后4 ℃，1 000 r/min離心5 min（離心半徑為7 cm），分別加入200 μL PBS重懸細胞，用流式儀檢測。

2.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量資料用“均數±標準差”（±s）表示。計量資料符合正態分布且方差齊，使用單因素方差分析，若不符合正態分布，則使用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組小鼠肺功能比較 模型組小鼠MV、PIF和PEF水平均低于空白組（P＜0.05）；中藥組和西藥組小鼠MV、PIF和PEF水平均高于模型組（P＜0.05）；中藥組小鼠MV、PIF和PEF水平均高于西藥組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠肺功能比較 （±s）

表1 各組小鼠肺功能比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05。

組別 n 給藥劑量 MV/mL PEF/（mL/s） PIF/（mL/s）空白組 8 - 44.85±3.05 4.53±0.32 3.71±0.16模型組 8 - 17.80±2.09a 2.37±0.19a 2.16±0.08a西藥組 8 4.160 mg/（kg·d） 31.48±1.90a b 3.64±0.23a b 2.57±0.09a b中藥組 8 6.565 g/（kg·d） 37.56±2.95a bc 3.69±0.87a bc 3.16±0.16a bc F 162.015 124.508 220.161 P 0.000 0.017 0.000

3.2 小鼠肺組織病理改變 空白組小鼠肺組織完整，肺泡無明顯破裂融合現象；模型組可見肺泡破裂融合，為明顯的COPD肺組織征象；與模型組比較，中藥組和西藥組肺泡破裂融合現象明顯減少。（見圖1）

圖1 小鼠肺組織病理圖 （HE，×100）

3.3 各組小鼠肺組織IL-6和IL-8水平比較 模型組小鼠肺組織IL-6和IL-8水平均高于空白組（P＜0.05）；西藥組、中藥組小鼠肺組織IL-6和IL-8水平均低于模型組（P＜0.05）；中藥組小鼠肺組織IL-6和IL-8水平均低于西藥組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠肺組織IL-6 和IL-8 水平比較 （±s，pg/mL）

表2 各組小鼠肺組織IL-6 和IL-8 水平比較 （±s，pg/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05。

組別 n 給藥劑量 IL-6 IL-8空白組 8 - 0.12±0.02 0.07±0.01模型組 8 - 0.26±0.02a 0.17±0.03a西藥組 8 4.160 mg/（kg·d） 0.21±0.02a b 0.15±0.02a b中藥組 8 6.565 g/（kg·d） 0.18±0.01a b c 0.13±0.02a b c F 84.301 37.696 P 0.001 0.000

3.4 小鼠肺組織CD68和CD206的表達 免疫熒光實驗結果顯示，各組小鼠均有不同程度的CD68和CD206陽性表達。其中CD68反映巨噬細胞激活程度，CD206反映巨噬細胞M2極化程度?？瞻捉M小鼠肺組織中CD68及CD206表達均不明顯，提示巨噬細胞處于未激活狀態。與其余各組比較，模型組的CD68陽性表達量最明顯，提示模型組肺組織中巨噬細胞被激活。中藥組和西藥組CD206陽性表達明顯升高，提示經過治療后，肺組織中巨噬細胞有向M2極化趨勢。（見圖2）

圖2 各組小鼠肺組織CD68 和CD206 的表達 （×200）

模型組小鼠肺組織CD68、CD206占比和CD206/CD68均高于空白組（P＜0.05）；西藥組、中藥組小鼠肺組織CD68占比低于模型組，CD206占比和CD206/CD68均高于模型組（P＜0.05）；中藥組小鼠肺組織CD68占比高于西藥組（P＜0.05），CD206占比和CD206/CD68均低于西藥組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠肺組織CD68、CD206 占比和CD206/CD68比較 （±s）

表3 各組小鼠肺組織CD68、CD206 占比和CD206/CD68比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05。

組別 n 給藥劑量 CD68占比/% CD206占比/% CD206/CD68空白組 8 - 2.40±0.18 0.06±0.01 0.03±0.01模型組 8 - 10.55±0.39a 2.64±0.32a 0.25±0.02a西藥組 8 4.160 mg/（kg·d） 6.43±0.33ab 3.65±0.19ab 0.57±0.05ab中藥組 8 6.565 g/（kg·d） 7.60±0.64abc 3.56±0.39abc 0.47±0.02abc F 1 460.409 946.189 794.516 P 0.030 0.000 0.028

3.5 小鼠肺組織巨噬細胞極化方向 CD86陽性比例反映巨噬細胞M1極化，CD163陽性比例反映巨噬細胞M2極化。模型組小鼠肺組織CD86陽性比例和CD86/CD163高于空白組（P＜0.05），提示巨噬細胞激活以M1極化為主。西藥組與中藥組小鼠肺組織CD86陽性比例和CD86/CD163低于模型組（P＜0.05），CD163陽性比例高于模型組（P＜0.05），提示巨噬細胞以M2方向極化趨勢為主。（見表4、圖3）

圖3 各組小鼠巨噬細胞M1、M2 型表達水平

表4 各組小鼠肺組織CD86、CD163 陽性比例及CD86/CD163 比較 （±s）

表4 各組小鼠肺組織CD86、CD163 陽性比例及CD86/CD163 比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05。

組別 n 給藥劑量 CD86陽性比例/% CD163陽性比例/% CD86/CD163空白組 8 - 0.36±0.03 0.52±0.07 0.70±0.01模型組 8 - 2.76±0.08a 0.62±0.05a 4.46±1.34a西藥組 8 4.160 mg/（kg·d） 0.85±0.06ab 1.83±0.14ab 0.47±0.04ab中藥組 8 6.565 g/（kg·d） 1.24±0.11abc 2.54±0.08abc 0.48±0.05abc F 522.299 310.593 1 426.198 P 0.000 0.000 0.000

4 討 論

COPD是一種常見的慢性疾病，尤以老年人多見，嚴重影響患者的生活質量[13]。COPD的急性發展與炎癥密切相關，抗炎貫穿COPD治療始終，控制炎癥的進展是治療COPD的重要組成部分。臨床常根據痰培養鑒定選出合適的敏感抗生素進行治療，當炎癥反應嚴重，難以控制時，常配合激素治療改善癥狀。巨噬細胞在炎癥反應過程中有著不可替代的作用[14-15]。在人體氣道表面，巨噬細胞廣泛分布，具有抵御外來病原微生物入侵和調節人體炎癥反應的作用[16]。巨噬細胞具有明顯的可塑性和非均一性，其激活狀態取決于其自身的局部微環境信號。目前，巨噬細胞的表型主要有兩類：經典活化型（M1極化）和替代活化型（M2極化），細胞因子和表型標志物可區分兩者[17]。M1極化后的巨噬細胞主要分泌IL-6、IL-12和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），具有積極的促炎作用，有利于機體對外來病原體的消滅清除，但是過度的炎癥反應對機體組織亦能造成損害[18]。M2型極化后的巨噬細胞主要分泌IL-10、轉化生長因子-β（TGF-β），具有積極的抗炎作用，有利于機體炎癥的減退，幫助組織修復[19]。研究表明，在COPD發生發展過程中，巨噬細胞的極化現象貫穿其中。對于極化方向，目前主流觀點認為，COPD往往由感染導致急性加重，巨噬細胞向M1轉化符合炎癥的發生發展規律[20]。

COPD屬中醫學中“肺脹”“喘證”等范疇。咳嗽、咳痰、胸悶氣促為主要表現。肺為嬌臟，喜潤惡燥。肺陰不足，宣降失常，氣滯飲停，聚而為痰。腎陰不足，腎不納氣，發為氣促[21-22]。金水六君煎養陰化痰，主治肺腎不足，水泛為痰。方中當歸補血活血；熟地黃補血滋陰，益精填髓。兩者合用，補肺腎之陰，以復肺臟宣降之權，腎臟納氣之能，治病之本[23]。半夏燥濕化痰，陳皮理氣健脾，茯苓利水滲濕。三者合用，健脾運濕，化痰止咳，治病之標。甘草調和諸藥。諸藥合用標本兼治，共奏滋養肺腎、止咳化痰之功?，F代藥理研究證實，當歸可以通過降低毛細血管的通透性、抑制炎癥因子的釋放、維持機體免疫細胞敏感性來起到抗炎的作用，同時當歸還可以通過增加免疫細胞的數量來起到提高免疫力的作用[24]。不同劑量地黃提取物能不同程度地提高T淋巴細胞比值和血清溶血素水平，從而提高機體免疫力。研究表明，地黃醋酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌等有明顯抑制作用[25]?，F代藥理研究表明，半夏提取物有顯著的鎮咳和祛痰作用[26]；陳皮具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基的作用[27]；茯苓具有增強特異性細胞免疫功能、抗炎、抗病毒等作用[28]。

本實驗結果顯示，模型組小鼠存在明顯COPD病理現象，肺功能各項指標惡化，提示COPD造模成功。經金水六君煎和甲潑尼龍干預后，小鼠肺組織病理和肺功能明顯改善，炎癥因子減少，提示兩者可通過抑制肺部炎癥治療COPD。同時，模型組肺泡巨噬細胞數增多，M1/M2型巨噬細胞百分比升高。經金水六君煎和甲潑尼龍干預后，小鼠肺泡巨噬細胞數降低，M1型巨噬細胞比例下降，M2型巨噬細胞比例上升，提示金水六君煎和甲潑尼龍可通過抑制肺泡巨噬細胞M1極化和促進M2極化來抑制肺部炎癥，達到治療COPD的作用。

綜上所述，COPD小鼠肺組織存在巨噬細胞極化M1/M2失衡。金水六君煎可能通過促進巨噬細胞M2極化起到改善肺部炎癥，從而起到治療COPD的作用。