赤芍-附片對慢加急性肝衰竭大鼠PI3K/AKT信號通路及相關炎癥因子表達的影響*

曹鈺楠，譚年花，唐陳琴，陳 斌

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院肝病研究所，湖南 長沙 410007）

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是在慢性肝病基礎上，由各種誘因引起肝功能急性失代償的臨床綜合征[1]。ACLF病情兇險，短期病死率高[2]。目前關于ACLF的發病機制主要集中在免疫炎癥失衡、氧化應激、細胞凋亡等方面，其中不同致病因素引起的免疫炎癥反應在ACLF的發生發展過程中極為關鍵，而全身炎癥反應既是ACLF的特征也是其驅動因素。促炎性細胞因子水平的升高及在免疫應答過程中各種免疫細胞的活化就是過度炎癥反應的表現[3]，同時也影響著患者的預后。前期研究[4-5]已證實溫陽解毒化瘀方治療肝衰竭療效確切，能夠減輕炎癥反應。溫陽解毒化瘀方以清溫并用法組方。赤芍-附片作為核心藥對彰顯了組方特點，在臨床配伍應用中具有高度代表性。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路是一條與炎癥、腫瘤、免疫性疾病等發病機制密切相關的胞內信號轉導途徑[6]。故本研究以PI3K/AKT信號通路作為切入點，探究赤芍-附片對ACLF的作用機制，旨在為赤芍-附片藥對治療ACLF提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠48只，體質量130～150 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，合格證號：ZS-202103230022。大鼠飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，室溫（24±2）℃，濕度40%～60%，晝夜明暗交替12 h。實驗經實驗動物倫理委員會批準（LLBH-202103160007）。

1.2 主要試劑與儀器 牛血清白蛋白（批號：A1933-5G）、D-半乳糖（批號：MB1853-1）、脂多糖（批號：MB5198-1）均購自美國Sigma 公司；白介素-1β（IL-1β）試劑盒（批號：KE00021-40000723）、白介素-6（IL-6）試劑盒（批號：KE00139-40000712）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號：KE00068-40000941）均購自美國Proteintech公司；p-PI3K抗體（批號：PA5-38905）購自Invitrogen Antibodies公司；PI3K抗體（批號：60225-1-Ig）、p-AKT抗體（批號：66444-1-Ig）、AKT抗體（批號：10176-2-AP）、山羊抗鼠二抗（批號：SA00001-1）、山羊抗兔二抗（批號：SA00001-2）均購自美國Proteintech公司；mRNA逆轉錄試劑盒（批號：CW2569）、miRNA逆轉錄試劑盒（批號：CW2141）均購自北京康為世紀生物科技有限公司。H1650R型冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽均購自北京六一儀器廠；BA210T型顯微鏡購自北京Motic公司；PIKOREAL96熒光定量RCP儀、SPL0960型熒光PCR板均購自美國Thermo公司。

1.3 實驗藥物 赤芍（批號：2012003C）、附片（批號21030068S）均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院，經藥學部鄧桂明研究員鑒定中藥為正品。制備方法：稱取對應劑量的赤芍、附片（赤芍組赤芍50 g；附片組附片15 g；赤芍-附片組赤芍50 g，附片15g），加入10倍量的水煮沸2 h，過濾藥液，藥渣加入8倍量水煮沸1 h，2次藥液混合后過濾，再用旋轉蒸發儀濃縮藥液至65 mL（藥液生藥質量濃度為1 g/mL）。乳果糖口服液（湖南科倫制藥有限公司，批號：H20093523，66.7 g/100mL）。

1.4 ACLF動物造模[7-8]適應性喂養1周，首先將48只大鼠隨機分為空白組（6只）、ACLF造模組（42只）。ACLF造模組大鼠構建ACLF模型。首先用牛血清白蛋白免疫致敏法構建免疫性肝纖維化大鼠模型，除空白組外的其余大鼠予牛血清白蛋白乳化液皮下多點注射致敏，0.5 mL/次（含牛血清白蛋白4 mg），分別在第1、15、25、35天注射，共4次；第36天起，予以尾靜脈注射牛血清白蛋白攻擊建立免疫性纖維化大鼠模型，初始劑量為2 mg/次，依次遞加0.5 mg/次，達4 mg/次后維持此劑量，每周注射2次，持續6周；最后在第6周末，通過腹腔注射D-半乳糖（600 mg/kg）+脂多糖（100 μg/kg）急性攻擊，構建ACLF大鼠模型。急性攻擊8 h后以10%水合氯醛（0.4 mL/100g）進行麻醉并采集腹主動脈血、肝組織等樣本以備檢測。

1.5 分組與給藥 至給藥干預前共存活33只大鼠。將33只造模大鼠隨機分為模型組（6只）、陽性組（乳果糖組，6只）、赤芍組（7只）、附片組（7只）、赤芍-附片組（7只）。在造模期間尾靜脈注射的第6周開始進行藥物灌胃干預，按人與大鼠等效劑量換算系數折算，赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠每日中藥等效劑量分別為4.50、1.35、5.85 g/kg，陽性組予乳果糖灌胃，大鼠每日等效劑量為1.8 g/kg。灌胃給藥，2次/d，給藥持續7 d至急性攻擊前。

1.6 觀察指標

1.6.1 肝功能、凝血酶原時間（PT） 采集腹主動脈血約5 mL，4 ℃，3 000 r/min（離心半徑為10 cm），離心15 min分離血漿，取上清后生化法檢測血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、總膽汁酸（TBA）；采用全自動血凝儀測定PT。

1.6.2 肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平 采用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）檢測肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。取各組大鼠肝組織研磨制備肝組織勻漿，重復凍融破壞細胞膜后離心取上清；設空白孔、標準品孔（50 μL）、樣本孔，樣本空中加入40 μL樣品稀釋液，逐步稀釋至5倍，除空白孔外每孔加入酶試劑100μL，封板，37 ℃恒溫孵育120 min，PBST洗滌后棄液，拍干；向孔中依次加入A、B顯色液，37 ℃避光顯色15～30 min；加入終止液50 μL終止反應；終止后15 min內測定OD值；制作標準曲線，計算樣本濃度。

1.6.3 大鼠肝組織病理變化 取各組大鼠肝組織，脫水透明后石蠟包埋，再進行切片、貼片，將切片60 ℃恒溫烘干。將烘干的切片用二甲苯、乙醇快速脫水。水洗后經蘇木素染色，沖洗、返藍后伊紅染色，洗滌后不同濃度乙醇脫水40 s，二甲苯透明切片，封片，蓋上蓋玻片固封。顯微鏡下觀察并取片。

1.6.4 肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量 采用蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量。取肝組織樣本，洗滌后加入RIPA裂解液，反復研磨組織；冰上裂解，4 ℃，12 000 r/min（離心半徑為10 cm），4 ℃，離心15 min，取上清。制膠，準備蛋白上清，根據蛋白定量結果加入樣本開始電泳；轉膜后用PBST沖洗，5%脫脂奶粉封閉90 min；抗體稀釋液稀釋一抗[PI3K（1∶5 000），P-PI3K（1∶1 000），AKT（1∶1 000），P-AKT（1∶2 000）]，孵育一抗，PBST洗滌；用抗體稀釋液稀釋HRP標記的二抗，HRP山羊抗鼠IgG（1∶5 000），HRP山羊抗兔IgG（1∶6 000），37 ℃孵育90 min；加入ECL化學發光液，用塑封膜將膜包裹雜交膜，曝光、顯影沖洗。

1.6.5 肝組織PI3KmRNA、AKT mRNA相對表達量 采用Realtime PCR法（RT-PCR）檢測肝組織PI K mRNA、AKT mRNA相對表達量。取肝組織樣本研磨，裂解，加入三氯甲烷后振蕩、靜置，4 ℃，12 000 r/min（離心半徑為10 cm），離心15 min，收集上清液，加入等體積異丙醇后混勻、靜置，再次離心后去除上清，加入無水乙醇洗滌，離心后棄掉廢液，室溫放置晾干，溶解沉淀，分光光度計測定RNA含量、純度，逆轉錄cDNA，然后進行定量PCR擴增（預變性：95 ℃，10 min；變性95 ℃，15 s；退火55 ℃，20 s；延伸60 ℃，30 s。循環40次），按照2-ΔΔCt方法計算PI3K mRNA、AKT mRNA的相對表達量。引物序列見表1，擴增曲線及溶解曲線見圖1～2。

表1 引物序列

圖1 PI3K mRNA 擴增及溶解曲線圖

圖2 AKT mRNA 擴增及溶解曲線圖

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行分析，計量資料用“均數±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，若不服從正態分布或方差不齊，則采用Kruskal-Wallis H檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝臟組織形態變化情況 空白組大鼠肝臟表面光滑，肝細胞無變性壞死，排列有序，肝小葉結構正常，中央靜脈清晰。模型組大鼠肝臟表面粗糙，可見顆粒狀結節，肝組織破壞，肝細胞形態變化，呈融合性壞死、點狀或灶狀壞死，肝小葉結構紊亂，纖維組織增生，多發性假小葉形成，伴大量炎癥細胞浸潤，表明ACLF造模成功[1]。陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組肝細胞壞死程度較模型組改善，纖維組織減少，肝小葉結構破壞減輕，匯管區少量炎癥細胞浸潤，以赤芍-附片組改善最為明顯。（見圖3）

圖3 各組大鼠肝臟病理圖 （HE，×400）

2.2 各組大鼠肝功能、PT比較 模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TBA、PT水平高于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TBA、PT水平均低于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TBA、PT水平均低于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清TBIL、ALT、AST、TBA、PT 比較 （±s）

表2 各組大鼠血清TBIL、ALT、AST、TBA、PT 比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n TBIL/（μmol/L） ALT/（IU/L） AST/（IU/L） TBA/（μmol/L） PT/s空白組 6 1.10±0.10 36.92±2.41 104.72±4.56 11.52±2.48 11.56±0.36模型組 6 4.56±0.41a 84.16±3.23a 246.02±12.61a 93.62±11.56a 15.66±0.27a陽性組 6 3.58±0.11bc 54.86±1.91bc 170.38±13.67bc 50.20±2.11bc 14.16±0.35bc赤芍組 7 2.74±0.32bc 49.02±4.90bc 157.10±6.00bc 41.42±5.65bc 13.68±0.76bc附片組 7 2.82±0.42bc 42.52±3.96bc 156.68±9.08bc 43.94±7.10bc 13.22±0.23bc赤芍-附片組 7 1.42±0.14b 31.94±2.18b 108.08±6.99b 22.68±3.61b 11.84±0.33b F 20.715 32.574 29.733 20.118 13.107 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 各組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 模型組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（±s，μg/mL）

表3 各組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（±s，μg/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n IL-1β IL-6 TNF-α空白組 6 420.84±27.14 1.56±0.12 37.41±3.69模型組 6 1 404.91±67.07a 4.10±0.35a 124.89±4.31a陽性組 6 920.08±57.39bc 3.15±0.14bc 89.85±5.82bc赤芍組 7 966.25±72.61bc 3.04±0.25bc 56.30±5.34bc附片組 7 730.49±56.27bc 2.85±0.15bc 64.21±3.11bc赤芍-附片組7 741.23±46.51b 1.88±0.22b 45.42±4.03b F 33.590 17.704 52.743 P 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量比較 模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量低于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量均高于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量高于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見圖4、表4）

表4 各組大鼠肝臟組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 各組大鼠肝臟組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n PI3K p-PI3K AKT p-AKT空白組 6 0.64±0.05 0.59±0.07 0.65±0.09 0.54±0.08模型組 6 0.65±0.05 0.15±0.02a 0.66±0.08 0.19±0.01a陽性組 6 0.66±0.04 0.38±0.05b c 0.66±0.07 0.45±0.04b c赤芍組 7 0.66±0.05 0.41±0.05b c 0.66±0.07 0.33±0.03b c附片組 7 0.66±0.06 0.37±0.04b c 0.69±0.07 0.48±0.04b c赤芍-附片組 7 0.62±0.05 0.61±0.04b 0.65±0.07 0.62±0.04b F 0.106 13.120 0.031 12.944 P 0.990 0.000 0.999 0.000

圖4 各組大鼠肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表達Western blotting 圖

2.5 各組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量比較 模型組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量低于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量高于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量高于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠肝臟組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量 （±s）

表5 各組大鼠肝臟組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n PI3K mRNA AKT mRNA空白組 6 1.030 6±0.078 8 0.938 6±0.076 5模型組 6 0.193 4±0.022 2a 0.110 1±0.014 6a陽性組 6 0.456 7±0.033 0b c 0.396 6±0.037 9b c赤芍組 7 0.349 3±0.030 3b c 0.261 4±0.024 5b c附片組 7 0.628 1±0.057 9b c 0.593 2±0.049 5b c赤芍-附片組 7 0.854 0±0.057 1b 0.800 2±0.067 2b F 38.995 40.519 P 0.000 0.000

3 討 論

炎癥和氧化應激是導致肝纖維化、肝細胞壞死、凋亡的重要因素[9-10]。為了維持內環境的穩定，肝臟固有免疫細胞（巨噬細胞/Kupffer細胞、自然殺傷細胞等）可吞噬、殺傷病原體，釋放大量細胞因子，如IL-6、IL-10等，促進炎癥因子風暴形成，加重肝衰竭。肝臟代償性免疫抑制及免疫功能紊亂導致患者全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），使膿毒癥的風險也隨之上升。過度的免疫炎癥反應會對組織造成嚴重病理損傷，引起肝臟組織嚴重壞死并導致肝外器官衰竭，同時也增加了感染的易感性[11]。因此，控制炎癥反應在肝衰竭的治療過程中尤為關鍵。目前中醫藥在治療肝衰竭方面逐漸顯露出其優勢[12-13]。

慢加急性肝衰竭屬于中醫“急黃”“瘟黃”“肝瘟”范疇，其致病因素包括外感時邪疫毒、嗜酒過度、藥物毒物、飲食所傷等。《諸病源候論·黃疸諸候·急黃候》記載：“谷氣郁蒸，因為熱毒所加，故卒然發黃……命在頃刻，故云急黃也。”隨著臨床經驗的積累，歷代醫家逐漸加深了對急黃（瘟黃）的認識，中醫大致將其基本病機總結為濕、熱、瘀、毒、虛。課題組前期通過觀察肝衰竭患者不同黃疸證型的臨床特點，總結出了“陽黃-陰陽黃-陰黃”中醫辨證論治體系，同時發現肝衰竭患者多是虛實夾雜，且疾病的發生發展過程中均存在濕熱、瘀毒、脾虛。濕熱瘀毒為標，脾虛為本。三者相互交織，發為肝瘟。赤芍-附片是治療肝衰竭“清溫并用”法的核心藥對，臨床療效確切。赤芍味苦，性微寒，歸肝經，具有清熱涼血、祛瘀止痛的功效。現代藥理學研究表明，赤芍可以降低炎癥因子水平，減輕炎癥反應，具有保肝作用[14-15]。附子，味辛，性大熱，上能助心陽，下可溫脾腎，主要有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效。現代藥理學研究表明，附子具有抗炎、鎮痛、強心、抗腫瘤等藥理作用，能降低促炎因子的產生與釋放[16]。但二者是否存在協同增效效應尚不清楚。

本研究結果表明，ACLF模型大鼠肝功能、凝血功能明顯下降，肝臟組織形態破壞，促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高，證實ACLF中存在明顯的炎癥反應。研究顯示TNF-α、IL-1β、IL-6是D-Gal/LPS誘導大鼠肝衰竭模型肝損傷的主要介質[17]，與本研究結果一致。本研究結果表明，在乳果糖、赤芍、附片、赤芍-附片藥對干預后，ACLF大鼠TBIL、ALT、AST、TBA和PT水平均較模型組改善，說明乳果糖、赤芍、附片、赤芍-附片藥均可改善肝功能、凝血功能，減輕肝臟組織壞死及炎癥細胞浸潤等病變，亦可降低ACLF大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平，抑制炎癥反應。赤芍-附片組肝功能、凝血、炎癥指標的整體改善比赤芍組、附片組更為顯著，說明兩者配伍的效果優于單用，可能與附片能提高赤芍的主要效應成分芍藥苷的生物利用度有關[18]。

PI3K是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶活性。PI3K是由一個催化亞基和一個調節亞基構成的異二聚體。其中調節亞基以p85異構體為主，主要包括SH2和SH3結構域，能與靶蛋白相結合，被受體酪氨酸激酶（TK）激活。AKT是一種絲/蘇氨酸激酶。因為與蛋白激酶A和蛋白激酶C具有高度的同源性，AKT又被稱為蛋白激酶B，亦稱為PKB或Rac，是PI3K通路中重要的中介因子[19]。AKT在多種細胞中廣泛表達。PI3K/AKT信號通路是一個依靠磷酸化傳導信號的通路，能夠多級調控、級聯放大，具有交通樞紐的地位。該信號通路被激活后，可繼續通過激活下游的多種靶點蛋白，參與細胞的增殖、凋亡、活化、分化、惡變等一系列細胞活動及調控蛋白合成、能量代謝、血管生成等重要的生理過程[20]，從而在各類疾病中起著重要調控作用。PI3K/AKT信號通路作為調節炎癥因子分泌的關鍵通路，在肝衰竭病理機制中具有重要意義，能傳導匯聚多種細胞外和細胞內信號，通過對下游效應因子的激活，調節促炎和抗炎細胞因子的產生。本研究結果也證實了這一點。本研究結果表明，模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白表達及PI3K mRNA、AKTmRNA表達均下降，說明PI3K/AKT信號通路參與了ACLF發生發展過程。陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白表達及PI3K mRNA、AKTmRNA表達均上升，說明乳果糖、赤芍、附片、赤芍-附片藥對均能激活PI3K/AKT信號通路，降低促炎因子水平。WANG H等[21]發現調節PI3K/Akt/STAT3信號通路能降低炎癥因子的表達進而改善肝損傷，與本研究結果一致。SUN X J等[22]證實調節PI3K/Akt-Nrf2通路能改善全身炎癥反應。WANG Y P等[23]研究表明，利用骨髓細胞2激活PI3K/AKT/FoxO3a信號通路可下調IL-5、TNF-α和IL-5β炎癥因子的表達。DONG L L等[24]研究表明PI3K/Akt/mTOR信號通路能抑制促炎性細胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的產生。另有研究[25]表明，在激活PI3K/AKT/FOXO1信號通路后，脂毒性誘導的炎癥反應得到明顯緩解。HEMAVATHY H等[26]發現干預PI3K/AKT信號傳導通路能抑制IL-1β、TNF-α的釋放，從而抑制炎癥反應。此外，本研究結果表明，赤芍組、附片組PI3K mRNA、AKT mRNA表達水平與PI3K、AKT蛋白表達水平不完全一致，可能是受翻譯速率、mRNA半衰期、蛋白折疊等多因素影響所致[27]。與模型組、赤芍組、附片組比較，赤芍-附片藥對組的p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平及PI3K mRNA、AKT mRNA表達水平上升最顯著，進一步說明了PI3K/AKT信號通路是參與肝衰竭持續性炎癥反應的重要通路。

綜上所述，赤芍-附片藥對可以改善ACLF大鼠的免疫炎癥反應，其對ACLF大鼠肝臟的保護作用可能與激活PI3K/AKT信號通路，下調炎癥因子的表達，從而減少炎癥因子的產生有關。然而，赤芍-附片藥對是否可以通過其他信號通路對ACLF產生影響有待進一步探究。