中醫藥治療青春期功能失調性子宮出血的用藥規律及新篩選方作用機制的網絡藥理學研究*

白 茸，姜 玥，韓延華，吳效科，張躍輝

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

功能失調性子宮出血（dysfunctional uterine bleeding，DUB）指月經周期、經期出現異常，多表現為月經的淋漓不盡或量大如潮[1]。DUB是無潛在結構異常情況下的異常子宮出血，占青春期異常子宮出血的95%[2]。本病屬中醫學中“崩漏”范疇，以“腎-天癸-沖任-胞宮”軸失調為基本病機，具有遷延難愈、易反復發作的特點。DUB為導致青春期女性住院的高發婦科疑難疾病，嚴重影響青春期女性正常學習和生活，容易給青少年造成極大的心理壓力。青春期DUB的治療方案多取決于出血的嚴重程度。此外，積極預防并發癥以及調整并重塑月經周期也是治療本病的基本原則。

中醫藥從辨證論治、審病求因的角度出發，在治療青春期DUB方面具有獨特優勢。盡管之前有學者分析總結DUB的用藥規律，但并未闡述其可挖掘的新組方。筆者收集中文文獻數據庫中中醫藥治療青春期DUB的醫案，借助中醫傳承輔助平臺，在分析其用藥規律和預測新方的基礎上，運用網絡藥理學和分子對接對其新方潛在作用機制進行研究，以期指導臨床。

1 資料與方法

1.1 數據來源 借助中國知網、萬方和維普數據庫，以“青春期”AND（“崩漏”OR“功血”OR“異常子宮出血”OR“功能失調性子宮出血”OR“排卵障礙性異常子宮出血”）AND（“中醫”OR“中藥”）為檢索詞，交叉檢索自建庫至2021年9月的相關文獻。

1.2 納入標準 （1）研究類型：實驗性研究、觀察性研究等治療組患者≥20例且有明確處方的文獻；（2）研究對象：臨床明確診斷為異常子宮出血或DUB患者，年齡9～20歲且無性生活史；（3）干預措施：治療組含有口服中藥湯劑；（4）隨證加減的納入其基礎方。

1.3 排除標準 （1）動物實驗類文獻、會議文件、綜述類文獻、重復文獻等；（2）處方不完整或含周期用藥的文獻；（3）中醫外治法等其他方式治療的文獻；（4）口服中成藥的文獻。

1.4 數據處理 將收集到中藥的名稱、功效及性味歸經參考2020年版《中華人民共和國藥典》[3]、《中華本草》[4]及《中藥學》[5]進行規范化處理。如炒地榆、地榆炭統一為地榆，炮制方法不同、功效有差異的分別記錄，如分別記錄荊芥穗、荊芥、荊芥穗炭。

1.5 青春期DUB用藥規律分析 利用中醫傳承輔助平臺對文獻所涉及中藥進行性味歸經、藥物頻數統計、關聯規則和潛在新方分析。

1.6 網絡藥理學機制探究 通過“1.5”用藥分析得到潛在新方，借助中醫藥數據庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform, TCMSP）[6]對新方2的中藥化學成分進行檢索，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18進行篩選[7-8]，并進行各成分靶點的收集，借助Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）[9]完成靶點與基因名的匹配。同時在Gene-Cards[10]、在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）數據庫中輸入關鍵詞“Dysfunctional uterine bleeding in adolescence”，收集疾病的相關靶標，將藥物的靶點與疾病的靶點進行映射，得到新方2治療青春期DUB的關鍵靶點。利用Cytoscape3.9.0構建“青春期DUB-藥物-化合物-靶點”網絡，采用STRING平臺、David數據庫對潛在作用靶點進行蛋白相互作用（PPI）網絡及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析[11]。通過PubChem、Uniport、蛋白質晶體結構數據庫（Protein Data Bank，PDB）獲取化合物和靶點的2D結構式，運用AutoDockVina程序對重要化合物和靶點進行分子對接，計算結合能大小，并利用PyMol軟件將結果可視化。

2 結 果

2.1 文獻納入情況 檢索得到文獻3 830篇，篩選刪除重復文獻后得到1 281篇文獻，根據納入標準、排除標準進一步閱讀后，最終共篩選出文獻140篇，涉及154個中藥復方，整理后錄入于中醫傳承輔助平臺（V2.5），建立數據庫。

2.2 高頻藥物分析 本研究最終納入154個中藥復方，涉及143味中藥，根據頻數從高到低排序，前5味中藥分別為白術、熟地黃、黃芪、山茱萸、阿膠。高頻中藥使用頻數及頻率見表1。

表1 高頻中藥頻數及頻率

2.3 性味歸經分析 143味中藥的藥性以溫[38.03%（618/1625）]、平[28.68%（466/1 625）]、寒[27.57%（448/1 625）]為主，藥味以甘[40.44%（1 081/2 673）]、苦[23.91%（639/2 673）]、辛[12.00%（321/2 673）]為主，歸經以肝經[29.27%（1148/3 922）]、腎經[23.33%（915/3 922）]、脾經[14.99%（588/3 922）]為主。（見圖1）

圖1 中藥四氣、五味、歸經雷達圖

2.4 基于關聯規則的方劑組方規律分析 對篩選出來的方劑進行組方規律分析，在中醫傳承輔助平臺數據分析版塊的組方規律中設置“支持度”為31[12]，“置信度”為0.8，得到21組高頻藥物模式，共包含12味中藥。（見表2）

表2 基于關聯規則的高頻藥對

2.5 新方分析 運用中醫傳承輔助平臺中數據分析版塊的新方分析功能，在相關度設置為系統隨機默認值5，懲罰度2的聚類基礎上，得到4個新方組合。（見表3）

表3 新方組合

2.6 網絡藥理學機制探究 對新方2（黨參+升麻+黃芪+女貞子+墨旱蓮）的成分和靶點進行篩選，得到靶點共1 276個，在GeneCards和OMIM數據庫中檢索青春期DUB的靶點，合并去重后得到青春期DUB靶點1 810個，將中藥靶點合并去重后與其映射得到中藥治療青春期DUB的關鍵靶點141個。運用String平臺對關鍵靶點進行PPI網絡分析，將結果導出保存，進一步運用Cytoscape將結果可視化優化處理。（見圖2）按照節點度值從高到底排序，前5的關鍵節點為AKT1、p53腫瘤蛋白（TP53）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、VEGFA，表明這些基因在新方2治療青春期DUB中具有重要作用。

圖2 新方2 藥物治療青春期DUB 的PPI 網絡

應用Cytoscape3.9.0軟件構建“青春期DUB-藥物-化合物-靶點”網絡，共包括196個節點，其中靶點占141個，疾病占1個，活性成分占49個，藥物占5個；經統計共有1 029條邊。（見圖3）其中MOL000098（quercetin、槲皮素）、MOL000006（luteolin、木犀草素）、MOL000422（kaempferol、山奈酚）為度值（degree）排名靠前的成分，在治療青春期DUB中有著重要作用。

圖3 青春期DUB-藥物-化合物-靶點網絡圖

對141個關鍵靶點通過David數據庫，進行KEGG通路分析，并通過閱讀文獻去除與青春期DUB關聯度小的疾病信號通路（如糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等），最終可視化關聯度較高的前20條信號通路。（見圖4）通路富集于癌癥通路、PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路等，其中NF-κB通路是最經典的與炎癥反應相關通路。

圖4 KEGG 通路分析

對閱讀文獻及分析結果得到的新方2治療青春期DUB的重要化合物槲皮素、木犀草素、山奈酚與潛在作用靶點AKT1、VEGFA、TNF、IL-6進行分子對接，對接結果得分均≤-5.0kcal/mol，初步推斷新方2與靶點有較好的結合活性，具體對接值見表4。對接結合力值越低表明配體和受體結合越穩定，越可能發生相互作用。VEGFA與槲皮素、木犀草素和山奈酚的結合力均較低，木犀草素與VEGFA的結合力值最低，為-7.4 kcal/mol（1 kcal≈4.186 kJ），表明其親和力強，對接可視化模型見圖5。

3 討 論

青春期DUB與青少年下丘腦-垂體-卵巢軸不成熟、機體性激素水平紊亂有關。青少年的異常子宮出血常被診斷為多囊卵巢綜合征（PCOS）[13]，同時DUB還是青春期PCOS的早期征兆[14]。DUB的危險因素除肥胖外，還可能與環境、精神情緒、內分泌等因素有關。西醫對于DUB的治療選擇包括口服避孕藥、孕激素、非甾體抗炎藥、氨甲環酸、GnRH類似物、達那唑和左炔諾孕酮釋放子宮內系統等，現多采用激素序貫療法[15]。臨床顯示，這些治療方法雖具有迅速止血的效果，但不良反應較大，病情易反復。中醫學認為本病的主要病機為臟腑失調，沖任損傷，不能制約經血[16]。其致病因素不外乎虛、熱、瘀，且青春期為腎氣尚未充盛之時，此期的女性體質多虛，易出現臟腑虛證。

本研究共納入中醫藥治療青春期DUB的方劑154個，涉及143味中藥，四氣以溫為主，五味以甘、苦為主。甘能緩急，而肝為木臟，主升發。甘溫可緩肝之急，溫腎陽健脾祛濕；苦能堅陰、燥濕，苦溫祛脾之寒濕。歸經以肝經為主。《臨證指南醫案》曰：“女子以肝為先天”[17]。可見肝在青春期DUB發病與治療中具有重要作用。中藥歸經其次為腎經、脾經等，印證了本病與肝、腎、脾等臟腑密切相關。其四氣、五味、歸經與臟腑疾病之間有較強的相關性，也證實本研究數據的準確性。

用藥頻數統計顯示，出現頻數較高的藥物有白術、熟地黃、黃芪、山茱萸等。根據支持度和置信度進行關聯規則分析，得出的主要藥對有黃芪-白術、女貞子-墨旱蓮、熟地黃-山茱萸等，以上藥物突出的功效主要有健脾益氣、滋陰補血、補氣升陽、補益肝腎、涼血止血等。《長沙藥解》言白術“最益脾精，大養胃氣”。《本草蒙筌》亦記載：“在氣主氣，在血主血。”故白術善助脾運以益氣攝血，且具有調節脾胃功能、抑制宮縮、增強機體免疫、調節生殖系統的作用[18-19]。白術與黃芪配伍為用，令脾氣旺而統攝有權。熟地黃，味甘，歸肝、腎經。熟地黃配山茱萸，滋補肝腎陰虛之效更佳。研究[20-23]證明熟地黃能止血、促進造血功能，且具有雌激素樣作用。女貞子、墨旱蓮為二至丸的組方藥物，一者甘苦，一者甘酸，相須配伍，可增強滋補肝腎的作用。黨參配白術、黃芪，益氣健脾養血。

本研究得到4個新方組合。新方1中茜草、地骨皮涼血止血，龍骨、牡蠣、海螵蛸收斂止血。新方1補斂兼顧，標本兼治，適合氣虛出血。新方2中黃芪、黨參、升麻健脾益氣；女貞子、墨旱蓮補腎滋陰，養血止血。新方2適合氣陰兩虛出血。新方3、新方4分別適合血瘀出血和腎虛出血。4個新方組合為二至丸、龍骨牡蠣湯、固崩止漏湯等重要組成成分。新方2中黨參性平味甘，治虛勞內傷、婦女血崩、胎產諸病”；升麻有升提下陷之中氣的作用；女貞子、墨旱蓮具有促凝止血[24]、免疫調節[25]、雌激素樣作用[26]。全方可理解為二至丸合補中益氣湯加減，尤其適用于肝腎陰虛伴脾虛肥胖型的異常子宮出血。

網絡藥理學結果顯示新方2治療青春期DUB的重要成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇等；新方2起效的關鍵蛋白主要是AKT1、TNF、IL6、VEGFA等。慢性子宮內膜炎癥可引發異常子宮出血[27]，而月經出血也可引發慢性子宮內膜炎。REAVEY J J等[28]研究表明，肥胖導致月經時局部子宮內膜炎癥狀態加重，炎癥介質TNF、IL6顯著增加，會延遲子宮內膜修復，增加失血量。異常子宮出血還可能與子宮內膜血管生成紊亂、子宮內膜微血管脆性增加及子宮內膜缺氧有關。槲皮素是一種重要的類黃酮，在卵巢發育中起雌激素樣作用。槲皮素可增加健康卵泡的體積和數量，減少閉鎖卵泡的數量[29]，調節卵巢功能，抑制子宮內膜增生、血小板聚集等，從而在“卵巢-子宮”的反饋下發揮止血的作用。木犀草素可通過抑制凝血酶原時間和激活部分凝血酶時間表現出止血活性。此外，木犀草素作為天然抗氧化劑，具備良好的自由基清除和細胞保護特性，可通過抑制核因子-κB的磷酸化，調節信號傳導及轉錄激活蛋白3（Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和激活蛋白1（Activator protein-1,AP-1）發揮抗炎作用[30]。VEGF是影響血管新生及內皮屏障保護的重要因子。雌激素也是內皮功能的重要調節因子，在子宮內膜中具有促血管生成和抗血管生成的雙重作用，可刺激內皮細胞VEGFA上調，降低周細胞對血小板衍生生長因子β（platelet derived growth factor, PDGF-β）招募活性的敏感度，消融新生血管芽的周細胞覆蓋，導致微血管不穩定，增加微血管壁的脆性，從而可能導致出血。AKT能在子宮內膜癌中調節孕激素受體B依賴的轉錄和血管生成。VEGF高表達可促進新生血管的生成，過度增厚子宮內膜進而引發內膜剝脫的突破性出血。GAO F等[31]研究證實AKT1在體內具有血管保護作用，被VEGF激活后可長期保護內皮屏障，促進子宮內膜的修復，從而起到止血的作用。山奈酚能顯著抑制炎癥，通過降低脂多糖（lipopol ysaccharide，LPS）誘導的TNF-α、IL-6、細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）過量生成，進而影響相關炎癥介質的釋放[32]。ICAM-1作為淋巴細胞功能相關分子1（lymphocyte Function-associated antigen1, LFA-1）的關鍵配體，在子宮內膜廣泛分布，可促進多種病理狀態下的白細胞招募。該分子在子宮內膜中具有重要的生理作用，可影響正常月經來潮[33]。二至丸治療肝腎陰虛型崩漏可能與AKT1、IL-6、TNF、TP53減少炎癥細胞的分泌，降低炎癥反應有關[24]。

分子對接顯示新方2的活性成分與靶點具有較好的結合能力，結合能均小于-5.0 kcal/mol。其中木犀草素與VEGFA的結合效果最佳。木犀草素、槲皮素能顯著抑制VEGF的表達，從而影響血管新生[34-35]。

KEGG通路富集結果顯示，相關靶點主要富集在PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路、癌癥通路等通路；子宮內膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，生殖器異常出血是子宮內膜癌最重要的癥狀。盡管大約80%的子宮內膜癌發生在絕經期或絕經后婦女，但發生在青少年的異常子宮出血不容小覷。有研究表明補腎中藥可通過PI3K/AKT/NF-κB信號通路，減少卵巢顆粒細胞凋亡，增加卵巢血流供應，進而提高卵巢功能[36]。盡管網絡藥理學對相關靶點進行了KEGG通路富集分析，但通路與DUB之間的研究較少，這或許可以為日后DUB通路的機制研究提供思路。

綜上所述，中醫多從肝腎論治青春期DUB，用藥性味以甘、溫為主，多入肝、腎、脾經。挖掘出的新方2藥物中主要活性成分為槲皮素和木犀草素，其主要通過AKT1、VEGFA等關鍵靶點及PI3K/AKT等信號通路來干預青春期DUB的進展，藥物起效可能與止血、抗炎及子宮內膜修復等機制相關，但仍有待于進一步實驗驗證及臨床實踐的探討。