五參湯加減對(duì)心肌梗死大鼠心臟功能及促血管生成作用的保護(hù)機(jī)制研究*

張富璋，魯衛(wèi)星

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

心肌梗死表現(xiàn)為心肌缺血壞死引起的胸痛，可伴有心律失常和心力衰竭。心肌梗死的死亡率較高，且我國(guó)的發(fā)病率增長(zhǎng)迅速[1]。研究[2]表明，為適應(yīng)心肌梗死后的缺氧狀態(tài)，心肌梗死周邊部位新生血管可在一定程度上恢復(fù)缺血心肌血流，改善心功能，因此近年來(lái)治療性血管新生的研究不斷深入。心肌梗死在中醫(yī)屬于“真心痛”“胸痹”等范疇。《諸病源候論》中“心里強(qiáng)痞急痛，肌肉苦痹，絞急如刺，不得俯仰”[3]描述了本病癥狀。本病屬本虛標(biāo)實(shí)，多發(fā)于中老年人。陽(yáng)氣漸虛，臟腑漸衰，心氣虧虛，血行無(wú)力，瘀血內(nèi)生，阻滯經(jīng)絡(luò)，故有心痛。《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論篇》中認(rèn)為“寒氣積于胸中而不瀉，……，凝則脈不通”[4]。陽(yáng)氣虛衰，無(wú)以溫化寒凝，胸痛更甚。針對(duì)此病機(jī)，中醫(yī)多采用益氣活血之法治療。五參湯加減具有益氣活血之效，臨床多用于治療心系疾病[5]，但關(guān)于其促血管生成和保護(hù)心臟的作用機(jī)制報(bào)道較少。本研究通過(guò)建立心肌梗死大鼠模型，探究五參湯加減對(duì)心肌梗死大鼠心臟功能及促血管生成的作用和機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康SPF級(jí)雄性SD大鼠82只，體質(zhì)量225～250 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h/12 h明暗交替光照，室溫22～25 ℃下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲食。實(shí)驗(yàn)操作流程嚴(yán)格遵照北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的相關(guān)法規(guī)。本研究經(jīng)本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2021-02S1號(hào)。

1.2 藥物與試劑 五參湯加減（太子參30 g，丹參15 g，沙參15 g，玄參15 g，苦參15 g，麥冬10 g，川芎10 g，炙甘草6 g）由本院藥房提供；鹽酸貝那普利片（批號(hào)：1920203，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030514）購(gòu)于北京諾華制藥；肌酸激酶MB（creatine kinase MB form，CK-MB）大鼠ELISA試劑盒（批號(hào)：125610）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）大鼠ELISA試劑盒（批號(hào)：156011）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）大鼠ELISA試劑盒（批號(hào)：062416）均購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule 1，CD31）抗體（批號(hào)：2411781021）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGF2R）抗體（批號(hào)：2635212140）、磷脂酰肌醇激酶3（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體（批號(hào)：3011771025）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗體（批號(hào)：2654105101）、p-AKT抗體（批號(hào)：0524A21）、過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG抗體（批號(hào)：0311A23）均購(gòu)于博士德生物工程有限公司；PCR引物設(shè)計(jì)、合成由上海生工完成；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：1014561）、PCR試劑盒（批號(hào)：1511051）均購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 SONOS 7500型三維超聲心動(dòng)圖（荷蘭飛利浦醫(yī)療器材集團(tuán)）；CX41-72000-2型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPAS公司）；Synergy2型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；ADI POWERLAB型多導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞AD Instruments公司）。

1.4 造模與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選出10只大鼠作為假手術(shù)組，其余大鼠復(fù)制心肌梗死大鼠模型[6]。具體操作：術(shù)前禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定，剪開頸部皮膚，氣管插管，使用小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行人工通氣（80次/min，潮氣量4 mL），并連接心電圖采集系統(tǒng)觀察大鼠心電圖變化，在左側(cè)第三、四肋間開胸，逐層分離肌肉，鑷子刺破胸膜暴露心臟，挑開心包膜，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處下方2～3 mm處開始結(jié)扎，當(dāng)觀察到搏動(dòng)減弱、心肌組織顏色變?yōu)榘导t或逐漸蒼白、心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上性抬高，即為造模成功；之后抽吸血液，逐層縫合；待蘇醒后拔除插管，縫合頸部。假手術(shù)組大鼠僅做氣管插管和開胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈直接縫合。造模過(guò)程中，有12只大鼠死亡，60只大鼠造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、五參湯加減低劑量組、五參湯加減中劑量組、五參湯加減高劑量組，每組10只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 造模后第2天開始給藥治療，五參湯加減低、中、高劑量組大鼠分別給予1.6、3.2、6.4 g/kg五參湯加減藥液灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠予10 mg/kg貝那普利灌胃，假手術(shù)組和模型組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 超聲心動(dòng)圖評(píng)估心臟功能 末次給藥1 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)評(píng)估心臟功能指標(biāo)，即左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular endsystolic dimension，LVESD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.6.2 取材 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)完成后，取腹主動(dòng)脈血5 mL，用于ELISA試劑盒檢測(cè)；處死大鼠，快速剖開胸腔，摘取心臟，生理鹽水洗去血液，同時(shí)去除心室周圍組織，一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE染色和免疫組化，一部分用于qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)。

1.6.3 HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變情況 4%多聚甲醛固定心肌組織48 h，制備石蠟切片，一部分用于HE染色，另一部分用于免疫組化實(shí)驗(yàn)，常規(guī)脫蠟水化，用蘇木素染色，鹽酸酒精分化，沖洗玻片，反藍(lán)3 min，沖洗玻片，伊紅染色，70%乙醇浸洗玻片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片、烘片，在顯微鏡下觀察組織形態(tài)是否發(fā)生病理改變。

1.6.4 免疫組化檢測(cè)微血管密度（microvessel density，MVD） 將石蠟切片二甲苯脫蠟、水化，修復(fù)抗原，滴加CD31抗體稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，隔日室溫孵育二抗1 h，DAB顯色，蘇木素染色后脫水，中性樹脂封片、烘片，光鏡下觀察CD31陽(yáng)性細(xì)胞（棕黃色），MVD為5個(gè)不同視野下單位面積內(nèi)CD31陽(yáng)性的微血管數(shù)量（管腔≤25 μm）的平均值。

1.6.5 ELISA法檢測(cè)CK-MB、BNP、TNF-α水平 將大鼠腹主動(dòng)脈血靜置2 h，1 000×g離心15 min，收集血清。操作步驟按照試劑盒要求進(jìn)行，在試劑盒提供的96孔板中加入血清，37 ℃孵育2 h，去除液體，加入生物素抗體，37 ℃孵育1 h，去除液體，洗板3次，加入HRP親和素，37 ℃孵育1 h，去除液體，洗板3次，加入底物，37 ℃避光孵育30 min，加入工作停止液，酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm處波長(zhǎng)，計(jì)算CK-MB、BNP、TNF-α水平。

1.6.6 qRT-PCR檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取大鼠心肌組織總RNA，紫外分光光度計(jì)定量后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。加入PCR引物配置PCR體系，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃15 min預(yù)變性，95 ℃30 s、60 ℃30 s、75 ℃30 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參計(jì)算2-ΔΔCt，即為目的基因VEGF mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.6.7 Western blotting檢測(cè)VEGF2R、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平心肌組織加入裂解液進(jìn)行冰上勻漿、裂解，10 000×g低溫離心15 min，取中層蛋白，水浴變性，BCA法進(jìn)行蛋白定量，制備電泳凝膠，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)模，采用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜（1∶1 000），洗膜后室溫孵育二抗2 h（1∶2 000），洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光，采集蛋白條帶圖像并用軟件分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心臟功能比較 治療期間無(wú)大鼠死亡。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD均明顯增加（P＜0.05），LVFS、LVEF均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和五參湯加減中、高劑量組大鼠LVEDD、LVESD均明顯減少（P＜0.05），LVFS、LVEF均明顯升高（P＜0.05）。五參湯加減低劑量組大鼠LVEDD、LVESD、LVFS、LVEF與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠心臟功能比較 （±s）

表2 各組大鼠心臟功能比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n LVEDD/mm LVESD/mm LVFS/% LVEF/%假手術(shù)組 10 4.78±0.71 2.51±0.20 58.08±6.82 90.43±5.63模型組 10 8.32±0.63a 6.10±0.31a 19.54±2.79a 45.30±3.16a五參湯加減低劑量組 10 8.17±0.86 5.98±0.45 20.96±2.67 47.58±3.95五參湯加減中劑量組 10 7.69±0.57b 5.03±0.63b 42.87±3.75b 70.54±4.36b五參湯加減高劑量組 10 6.36±0.75b 4.64±0.58b 51.46±4.83b 77.59±4.72b陽(yáng)性對(duì)照組 10 6.81±0.79b 4.72±0.42b 50.65±4.18b 79.22±4.76b F 25.627 18.635 89.630 225.360 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 各組大鼠心肌組織病理改變和MVD比較 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞無(wú)明顯異常，纖維排列整齊，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠出現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列紊亂，肌束斷裂；陽(yáng)性對(duì)照組和五參湯加減低、中、高劑量組大鼠心肌組織上述病理改變有不同程度的改善。（見圖1）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠MVD明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和五參湯加減中、高劑量組大鼠MVD均明顯升高（P＜0.05）；五參湯加減低劑量組大鼠MVD與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖2）

圖1 各組大鼠心肌組織病理切片圖 （HE，×400）

圖2 各組大鼠MVD 比較 （±s，n=10）

2.3 各組大鼠血清CK-MB、BNP、TNF-α水平比較 模型組大鼠血清CK-MB、BNP、TNF-α水平均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組和五參湯加減中、高劑量組大鼠血清CK-MB、BNP、TNF-α水平均明顯低于模型組（P＜0.05）；五參湯加減低劑量組大鼠血清CK-MB、BNP、TNF-α水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清CK-MB、BNP、TNF-α 水平比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n CK-MB/（U/L） BNP/（U/L） TNF-α/（ng/L）假手術(shù)組 10 17.31±0.97 0.29±0.07 73.27±4.18模型組 10 38.14±1.42a 1.87±0.21a 185.77±18.36a五參湯加減低劑量組 10 37.66±1.53 1.79±0.24 173.48±20.54五參湯加減中劑量組 10 28.58±1.84b 1.05±0.23b 104.59±14.51b五參湯加減高劑量組 10 23.04±1.77b 0.69±0.12b 72.64±8.16b陽(yáng)性對(duì)照組 10 26.67±1.65b 0.72±0.16b 75.20±12.28b F 76.320 8.691 316.120 P 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠心肌組織VEGF mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織VEGF mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和五參湯加減中、高劑量組大鼠心肌組織VEGF mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；五參湯加減低劑量組大鼠心肌組織VEGF mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠心肌組織VEGF mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 各組大鼠心肌組織VEGF mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n VEGF mRNA PI3K mRNA AKT mRNA假手術(shù)組 10 1.00±0.02 1.01±0.05 0.99±0.04模型組 10 0.71±0.08a 0.76±0.13a 0.83±0.05a五參湯加減低劑量組 10 0.73±0.10 0.78±0.15 0.82±0.07五參湯加減中劑量組 10 0.84±0.12b 0.93±0.12b 0.91±0.12b五參湯加減高劑量組 10 0.97±0.15b 0.99±0.06b 1.02±0.08b陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.91±0.13b 0.96±0.14b 0.90±0.11b F 12.301 8.652 14.333 P 0.000 0.000 0.000

2.5 各組大鼠心肌組織VEGF、PI3K、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織VEGF、PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-AKT/AKT均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和五參湯加減中、高劑量組大鼠心肌組織VEGF、PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-AKT/AKT均明顯升高（P＜0.05）；五參湯加減低劑量組大鼠心肌組織VEGF、PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-AKT/AKT與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組大鼠心肌組織VEGF、PI3K、AKT 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖4 各組大鼠心肌組織VEGF、PI3K、AKT 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=10）

3 討 論

心肌梗死以氣虛、瘀血多見，治療時(shí)應(yīng)當(dāng)以益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀為原則。五參湯加減組成包括太子參、丹參、沙參、玄參、苦參、麥冬、川芎、甘草。方中太子參益氣，丹參、川芎活血祛瘀，沙參、玄參、麥冬養(yǎng)陰，苦參清熱，炙甘草益氣復(fù)脈。現(xiàn)代藥理研究[7-10]表明，太子參中的粗多糖和皂苷類均具有保護(hù)心肌的作用；丹參酮ⅡA具有強(qiáng)大的抗血管炎癥的作用；苦參總堿可抑制心肌細(xì)胞凋亡；玄參提取物具有舒張血管、抗心肌纖維化的作用。臨床上，血清CK-MB升高表明心肌損傷，BNP則反映了左心室功能障礙程度，TNF-α升高與炎癥反應(yīng)相關(guān)[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞壞死且有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示造模成功；在經(jīng)五參湯加減治療后，LVEDD、LVESD及血清中CK-MB、BNP、TNF-α降低，LVFS、LVEF升高，且心肌病理改變有所改善，說(shuō)明五參湯加減可改善心肌梗死大鼠的心肌損傷和心肌重塑。安琪等[13]采用電針聯(lián)合藥物治療急性心肌梗死大鼠，發(fā)現(xiàn)LVEF、LVFS升高；張亞平等[14]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可降低心肌梗死大鼠CK-MB、TNF-α水平，均與本研究結(jié)果一致，表明五參湯加減可改善心肌梗死大鼠心功能和心臟重塑，減輕炎癥反應(yīng)。

血管生成是心肌梗死后緩解缺血的病理過(guò)程之一，因此治療性血管生成被認(rèn)為是一種有效的心肌保護(hù)策略，這一過(guò)程涉及多個(gè)信號(hào)通路。在心肌梗死發(fā)生后，心肌細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)HIF-1的生成適應(yīng)缺氧環(huán)境，而HIF-1可增強(qiáng)其下游靶基因表達(dá)，VEGF則是其下游的靶基因之一。此外，肥大細(xì)胞也可釋放VEGF。VEGF的受體VEGFR2在心肌梗死小鼠的心肌細(xì)胞中大量表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成[15-16]。CD31是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，用于評(píng)價(jià)微血管密度[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成，可通過(guò)下游靶點(diǎn)HIF-1α調(diào)控VEGF表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死大鼠經(jīng)五參湯加減治療后，其梗死周圍心肌組織MVD明顯上升，VEGF mRNA表達(dá)上調(diào)，VEGF2R蛋白表達(dá)增加，且PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)上調(diào)，PI3K蛋白表達(dá)量和p-AKT/AKT升高。白曉君等[19]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮可上調(diào)心肌梗死大鼠VEGF、VEGFR2表達(dá)；FENG Q等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN抑制劑可通過(guò)激活PI3K/AKT/VEGF信號(hào)通路，促進(jìn)心肌梗死小鼠血管生成，與本研究相一致，表明五參湯加減可促進(jìn)心肌梗死后的血管生成，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，五參湯加減可改善心肌梗死大鼠心臟功能和心臟重塑，減輕炎癥反應(yīng)，促血管生成，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)。