絲氨酸/蘇氨酸磷酸蛋白磷酸酶4C在胃癌中的表達水平及其與預后的相關性

耿志軍 黃菊 李晴晴 周芷萱 李靜 張小鳳 王煉 王月月 宋雪 左蘆根

基金項目：安徽省高校自然科學研究項目（KJ2020A0563）、安徽省衛生健康科研項目（AHWJ2022a019）和癌癥轉化醫學安徽省重點實驗室開放課題（KFDX202202）

摘要：目的? 分析絲氨酸/蘇氨酸磷酸蛋白磷酸酶4C（PPP4C）在胃癌中的表達水平及與預后的相關性，并探究其可能的作用途徑和機制。方法? 收集2012年1月至2016年8月蚌埠醫學院第一附屬醫院收治的104例胃癌患者的臨床資料，采用免疫組織化學染色技術檢測胃癌組織中PPP4C和Ki-67的表達水平。培養BGC823和HGC27胃癌細胞，分別轉染PPP4C敲減、過表達和對照慢病毒載體，分析PPP4C對細胞周期和增殖的影響及可能的調控機制。結果? PPP4C在胃癌組織中呈高表達（P＜0.001），且與腫瘤的惡性進展呈正相關（P均＜0.01）。單因素和Cox回歸模型分析顯示，PPP4C高表達是影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素（P=0.003）。基因功能注釋和京都基因與基因組組百科全書富集分析提示PPP4C生物學功能可能與細胞周期有關。相關性分析顯示胃癌組織中PPP4C與Ki-67的表達量呈正相關（P＜0.001）。上調PPP4C增加S期胃癌細胞比例和減緩G2/M期阻滯，并促進細胞增殖以及Cyclin D1和細胞分裂蛋白激酶6（CDK6）、p53的表達（P均＜0.05）；下調PPP4C減少S期胃癌細胞比例和促進G2/M期阻滯，抑制細胞增殖以及Cyclin D1、CDK6和p53的表達（P均＜0.05）。p53抑制劑促進PPP4C敲減組BGC823和HGC27胃癌細胞的增殖（P＜0.001，P＜0.001），p53激活劑抑制PPP4C過表達組BGC823和HGC27胃癌細胞的增殖（P＜0.001，P=0.002）。結論? PPP4C在胃癌中高表達且影響患者預后，其可能通過抑制p53信號通路增加S期胃癌細胞比例和減緩G2/M期阻滯，進而促進細胞增殖。

關鍵詞：胃癌；絲氨酸/蘇氨酸磷酸蛋白磷酸酶4C；預后；細胞周期；p53

中圖分類號： R735.2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0721-09

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15568

Association of Serine/Threonine Phosphoprotein Phosphatase 4C Expression With Prognosis of Gastric Cancer

GENG Zhijun1，2，HUANG Ju3，LI Qingqing3，ZHOU Zhixuan2，LI Jing1，3，ZHANG Xiaofeng1，2，WANG Lian1，4，WANG Yueyue1，3，SONG Xue1，2，ZUO Lugen1，4

1Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-Related Diseases，2Central Laboratory，3Department of Clinical Laboratory，4Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu，Anhui 233000，China

Corresponding author：ZUO Lugen? Tel：0552-3086267，E-mail：zuolugen@bbmc.edu.cn

ABSTRACT：Objective? To investigate the expression level of serine/threonine phosphoprotein phosphatase 4C（PPP4C）in gastric cancer，and analyze its relationship with prognosis and the underlying regulatory mechanism.Methods? The clinical data of 104 gastric cancer patients admitted to the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College between January 2012 and August 2016 were collected.Immunohistochemical staining was employed to determine the expression levels of PPP4C and Ki-67 in the gastric cancer tissue.The gastric cancer cell lines BGC823 and HGC27 were cultured and transfected with the vector for PPP4C knockdown，the vector for PPP4C overexpression，and the lentiviral vector（control），respectively.The effects of PPP4C on the cell cycle and proliferation were analyzed and the possible regulatory mechanisms were explored.Results? PPP4C was highly expressed in gastric cancer（P<0.001），and its expression promoted malignant progression of the tumor（all P<0.01）.Univariate and Cox multivariate analysis clarified that high expression of PPP4C was an independent risk factor affecting the 5-year survival rate of gastric cancer patients（P=0.003）.Gene ontology and Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis suggested that PPP4C may be involved in the cell cycle.The correlation analysis showed that the expression of PPP4C was positively correlated with that of Ki-67 in gastric cancer（P<0.001）.The up-regulation of PPP4C expression increased the proportion of tumor cells in the S phase，alleviated the G2/M phase arrest，and promoted the proliferation of gastric cancer cells and the expression of cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 6（CDK6）（all P<0.05）.The down-regulation of PPP4C decreased the proportion of gastric cancer cells in the S phase，promoted G2/M phase arrest，and inhibited cell proliferation and the expression of cyclin D1，CDK6，and p53（all P<0.05）.p53 inhibitors promoted the proliferation of BGC823 and HGC27 cells in the PPP4C knockdown group（P<0.001，P<0.001），while p53 activators inhibited the proliferation of BGC823 and HGC27 cells in the PPP4C overexpression group（P<0.001，P=0.002）.Conclusions? PPP4C is highly expressed in gastric cancer and affects the prognosis of the patients.It may increase the proportion of gastric cancer cells in the S phase and alleviate the G2/M phase arrest by inhibiting p53 signaling，thereby promoting cell proliferation.

Key words：gastric cancer；serine/threonine phosphoprotein phosphatase 4C；prognosis；cell cycle；p53

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：721-729

2022年全球癌癥報告顯示，胃癌的發病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第3位和第5位［1］，而發病機制不明是阻礙胃癌治療和預防的根本性因素之一［1-2］。腫瘤細胞增殖失控是腫瘤惡性進展和患者預后不良的重要因素，相關機制研究有望為臨床治療提供新的分子靶標［3-4］。最新研究發現，絲氨酸/蘇氨酸磷酸蛋白磷酸酶4C（serine/threonine phosphoprotein phosphatase 4C，PPP4C）在乳腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達，通過促進細胞增殖影響腫瘤的進展和預后［5-6］。但PPP4C在胃癌組織中的表達與患者預后和腫瘤細胞惡性行為之間的關系尚不清楚。本研究納入接受胃癌根治術治療患者的臨床數據和病理標本，分析胃癌組織中PPP4C的表達情況及其對預后的影響，并通過基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集預測和細胞學驗證分析PPP4C可能的作用途徑和分子機制，以期為胃癌預后的評估提供新的參考。

資料和方法

資料來源和分組? 2012年1月至2016年8月蚌埠醫學院第一附屬醫院收治的104例胃癌患者，納入標準：病理診斷為胃癌，且接受根治性R0切除手術。排除標準：合并其他器官的惡性腫瘤；術前接受其他抗腫瘤治療；術后死于除胃癌外的其他原因。采用免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色技術檢測胃癌組織中PPP4C的表達水平，以其相對表達量的中位數為分界值，將患者分為PPP4C高表達組（n=52）和低表達組（n=52）。

臨床數據采集? 一般資料：從電子病歷系統中收集患者的性別、年齡、手術病理診斷、臨床分級以及術前外周血癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）水平等資料。生存資料：電話隨訪截止日期為2021年8月，收集患者死亡原因和時間。病理資料：病理科調取104例胃癌患者的手術標本病理蠟塊，采用IHC染色檢測胃癌和癌旁組織中PPP4C和腫瘤增殖標志分子Ki-67的表達水平；從104例胃癌患者的冰凍組織中隨機選取3例，采用免疫印跡法分析PPP4C蛋白水平。

IHC染色檢測PPP4C和Ki-67的表達? 將蠟塊制成4 μm厚度切片，依次經烤片、常規脫蠟水化、抗原修復、H2O2處理、封閉后，分別加入一抗1∶200 PPP4C（中國武漢博士德生物工程有限公司）、1∶400 Ki-67（英國Abcam公司）4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后加入過氧化物酶標山羊抗兔IgG室溫孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，于倒置熒光顯微鏡下采集圖片，采用Image J軟件分析PPP4C和Ki-67的相對積分光密度（integral optical density，IOD）值。陰性對照實驗設置：使用抗體稀釋緩沖液代替一抗進行孵育，其余操作步驟同前。

GO和KEGG富集預測分析PPP4C的生物學功能和機制? 經cBioPortal數據庫獲得PPP4C與胃癌的相關基因，再將相關基因導入DAVID數據庫進行KEGG和GO的預測富集分析。

細胞轉染及處理? 胃癌細胞BGC823和HGC27用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，取對數生長期細胞以4×105個/孔的密度接種于6孔板中，待其生長至60%～70%時，更換新鮮培養基，分別轉染PPP4C特異性敲減（siRNA：GGCUUCUAUAGCGUCG-AAATTUUUCGACGCUAUAGAAGCCTT）［5］、過表達和對照慢病毒載體，培養3 d后，使用含0.5 μg/ml和0.1 μg/ml嘌呤霉素的RPMI-1640培養基分別篩選轉染表達穩定的BGC823和HGC27細胞株，采用免疫印跡法驗證其干預效果。敲減和過表達PPP4C的BGC823和HGC27細胞使用無血清RPMI-1640培養基培養24 h，分別加入p53激活劑（20mol/L SLMP53-1）和抑制劑（10mol/L，PFT-α）培養24 h后，收集細胞用于后續實驗。

CCK-8檢測細胞增殖? BGC823和HGC27細胞以1×103個/孔的密度接種于96孔板中，培養24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h，置于酶標儀中測定450 nm處吸光度值。

流式細胞術檢測細胞周期? 收集BGC823和HGC27細胞，70%乙醇固定，參照細胞周期檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書進行染色和上機檢測，分析其細胞周期分布情況。

免疫印跡法檢測蛋白表達? BGC823和HGC27細胞經RIPA裂解后提取總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，吸取40g蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，封閉后分別加入PPP4C、Cyclin D1、細胞分裂蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）、p53和β-actin抗體（1∶1000）4 ℃孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG，TBST洗滌后，滴加ECL發光液，使用美國BioRad多功能凝膠成像系統采集圖片，Image J軟件量化分析。

統計學處理? 采用SPSS 26.0軟件，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey多重檢驗法；計數資料以構成比表示，組間比較采用χ2檢驗，當期望頻數＜5采用Fisher精確檢驗法。采用Spearman法計算相關系數。生存率采用Kaplan-Meier曲線進行分析，組間比較采用Log-rank χ2檢驗。影響胃癌患者術后生存期的危險因素采用Cox回歸模型（Enter法）分析；診斷價值分析采用二分類模型受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

基本情況? 104例胃癌患者中，男82例，女22例；<60歲43例，≥60歲61例；CEA<5 μg/L 52例，≥5 μg/L 52例；CA19-9<37 kU/L 58例，≥37 kU/L 46例；腫瘤大小<5 cm 59例，≥5 cm 45例；腺癌79例，其他類型25例；病理G1～G2級59例，G3～G4級45例，T1～T2期47例，T3～T4期57例，N0～N1期50例，N2～N3期54例。IHC染色和免疫印跡法結果顯示，PPP4C在胃癌組織中呈高表達（P＜0.001），且主要定位于癌細胞的細胞核中（圖1）。

胃癌組織PPP4C表達量與預后的相關性? PPP4C高表達組（IOD值≥2.837）患者外周血CA19-9≥37 kU/L（P=0.002）、CEA≥5 μg/L（P＜0.001）和病理分期N2～N3（P=0.006）、T3～T4（P=0.001）的比例顯著高于低表達組（IOD值＜2.837），而年齡（P>0.999）、性別（P=0.163）、腫瘤大小（P=0.843）、組織分型（P=0.491）及病理G分級（P=0.843）方面兩組間差異無統計學意義（表1）。與低表達組比較，高表達組胃癌患者術后5年生存率顯著降低（P＜0.001）（圖2A）。ROC分析結果顯示，以PPP4C相對表達量2.815為截點值，PPP4C預測胃癌患者術后5年生存率的敏感度、特異度和曲線下面積分別為75.00%、80.77%和77.64%（P＜0.001）（圖2B）。Cox回歸模型分析顯示，PPP4C高表達（P=0.003）、CEA≥5 μg/L（P=0.011）、CA19-9≥37 kU/L（P=0.010）、T3～T4期（P=0.010）及N2～N3期（P=0.020）是影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素（表2）。

網絡信息學富集分析? GO和KEGG富集分析顯示，PPP4C在胃癌中的生物學功能可能與細胞周期有關（圖3）。

PPP4C表達對細胞周期的影響? 免疫印跡法結果顯示，與對照組比較，胃癌BGC823和HGC27細胞敲減組PPP4C表達水平降低（P=0.031，P=0.003），過表達組PPP4C表達水平顯著升高（P=0.001，P=0.003）（圖4A、4B）。流式細胞術結果顯示，與對照組比較，胃癌BGC823和HGC27細胞PPP4C過表達組S期細胞比例增多（P=0.001，P=0.012），而G2/M期細胞比例下降（P=0.028，P=0.022）；而敲減組S期細胞比例下降（P=0.017，P=0.010）而G2/M期細胞比例增多（P=0.029，P=0.001）（圖4C、4D）。此外，免疫印跡結果顯示，胃癌BGC823和HGC27細胞PPP4C過表達可促進Cyclin D1（P=0.002，P=0.011）和CDK6（P=0.001，P<0.001）表達，敲減則抑制Cyclin D1（P=0.008，P=0.006）和CDK6表達（P=0.002，P=0.012）（圖4E、4F）。

PPP4C對胃癌細胞增殖的影響? CCK-8法檢測結果顯示，過表達PPP4C可促進BGC823和HGC27細胞的增殖（P＜0.001，P＜0.001），而敲減則抑制細胞增殖（P=0.014，P=0.010）（圖5A）。Ki67在胃癌組織中呈高表達（P＜0.001），且與PPP4C的表達呈正相關（r=0.672，P＜0.001）（圖5B～5D）。

PPP4C對p53通路的調控作用? 免疫印跡法結果顯示，PPP4C過表達組中p53的表達下調（P=0.019，P=0.030），而敲減組表達上調（P=0.001，P＜0.001）（圖6A、6B）。p53抑制劑PFT-α促進PPP4C敲減組BGC823和HGC27細胞的增殖（P＜0.001，P＜0.001），p53激活劑SLMP53-1抑制PPP4C過表達組BGC823和HGC27細胞的增殖（P＜0.001，P=0.002）（圖6C）。

討論

胃癌患者的預后不良與腫瘤細胞惡性增殖密切相關［1］。本研究結果顯示，PPP4C在胃癌組織中高表達，與胃癌惡性進展相關，并影響患者術后生存期，體外細胞研究發現其可能通過抑制p53通路增加S期胃癌細胞比例和減緩G2/M期阻滯，進而促進胃癌細胞惡性增殖。

既往研究證實，PPP4C在乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中高表達，且與癌細胞增殖等惡性行為密切相關［5-6］。為探索PPP4C在胃癌發生發展中的作用，本研究通過對胃癌患者的臨床資料和病理標本分析發現，PPP4C在胃癌組織中呈高表達，且其表達水平與外周血CEA、CA19-9、T和N分期等胃癌臨床進展指標呈正相關。為進一步闡明PPP4C高表達是否為影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素，本研究采用單因素和多因素分析，結果顯示PPP4C高表達、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3～T4期及N2～N3期是影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素。盡管本研究結果證實了胃癌組織中PPP4C表達水平與腫瘤惡性進展和患者預后不良相關，但其作用途徑和調控機制尚不清楚。

PPP4C是一種普遍存在的蛋白磷酸酶亞基，在進化過程中高度保守，但是其在惡性腫瘤中的生物學功能至今尚未完全闡明［7］。有研究表明，PPP4C可促進乳腺癌和肺癌細胞的增殖，且沉默人胚胎腎細胞中PPP4C的表達可導致M期阻滯，但關于PPP4C參與胃癌細胞增殖和細胞周期的研究報道較少［5-6，8］。本研究通過GO和KEGG富集分析發現，PPP4C的生物學功能主要與細胞周期進程和增殖的調控密切相關，包括細胞周期G2/M轉變、DNA復制和修復、細胞分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離及核糖體合成等。本研究中為了驗證PPP4C是否可以調控胃癌細胞的周期變化和增殖能力，采用慢病毒干預PPP4C的表達，通過流式細胞術和免疫印跡法發現，過表達PPP4C增加S期細胞比例和細胞周期蛋白Cyclin D1和CDK6的表達，以及減緩G2/M期阻滯，而敲減PPP4C則減少S期細胞比例和增強G2/M期阻滯。此外，通過人體組織學研究發現，胃癌組織中PPP4C與腫瘤增殖標志物Ki-67的表達呈正相關，并且體外實驗證實PPP4C促進胃癌細胞的增殖。本研究結果提示PPP4C具有增加S期細胞比例和減緩G2/M期阻滯，進而促進細胞增殖的作用。

既往研究顯示腫瘤抑制蛋白p53作為細胞增殖和凋亡的關鍵調節因子，在細胞周期檢查點中起到關鍵作用，且其可通過降低Cyclin D1的表達水平參與細胞G1/S期轉變［9-12］。為探究PPP4C促進胃癌細胞增殖是否與p53信號通路有關，本研究通過體外實驗發現，過表達PPP4C可抑制p53信號的激活，而p53激活劑可以減弱過表達PPP4C對胃癌細胞增殖的促進作用；敲減PPP4C可促進p53信號的活化，而p53抑制劑可以減弱敲減PPP4C對胃癌細胞增殖的抑制作用。提示PPP4C促進胃癌細胞增殖和S期細胞比例增多以及減緩G2/M期阻滯可能與抑制p53信號有關。

本研究存在以下不足：（1）本研究為回顧性研究，由于樣本量有限，關于PPP4C表達與腫瘤惡性進展和預后相關的結論仍需要前瞻性研究加以驗證。（2）盡管本研究通過細胞學實驗證實PPP4C促進胃癌細胞的增殖與負向調控p53有關，但是由于PPP4C生物學功能的多樣性和分子調控機制的復雜性，不能排除其通過其他生物學途徑或分子機制影響胃癌細胞惡性增殖的可能。

綜上，本研究結果表明，PPP4C在胃癌組織中呈高表達，并影響疾病惡性進展和患者預后，其可能通過抑制p53信號通路促進胃癌細胞的S期細胞比例增多和減緩G2/M期阻滯，進而促進胃癌細胞的增殖。

參考文獻

［1］Smyth EC，Nilsson M，Grabsch HI，et al.Gastric cancer[J].Lancet，2020，396（10251）：635-648.DOI：10.1016/S0140-6736（20）31288-5.

［2］Ford AC，Yuan Y，Moayyedi P.Helicobacter pylori eradication therapy to prevent gastric cancer：systematic review and meta-analysis[J].Gut，2020，69（12）：2113-2121.DOI：10.1136/gutjnl-2020-320839.

［3］Thrift AP，El-Serag HB.Burden of gastric cancer[J].Clin Gastroenterol Hepatol，2020，18（3）：534-542.DOI：10.1016/j.cgh.2019.07.045.

［4］Li GZ，Doherty GM，Wang J.Surgical management of gastric cancer：a review[J].JAMA Surg，2022，157（5）：446-454.DOI：10.1001/jamasurg.2022.0182.

［5］Xie W，Sun Y，Zeng Y，et al.Comprehensive analysis of PPPCs family reveals the clinical significance of PPP1CA and PPP4C in breast cancer[J].Bioengineered，2022，13（1）：190-205.DOI：10.1080/21655979.2021.2012316.

［6］Raja R，Wu C，Bassoy EY，et al.PP4 inhibition sensitizes ovarian cancer to NK cell-mediated cytotoxicity via STAT1 activation and inflammatory signaling[J].J Immunother Cancer，2022，10（12）：e005026.DOI：10.1136/jitc-2022-005026.

［7］Dong MZ，Ouyang YC，Gao SC，et al.PPP4C facilitates homologous recombination DNA repair by dephosphorylating PLK1 during early embryo development[J].Development，2022，149（10）：dev200351.DOI：10.1242/dev.200351.

［8］Gao G，Zhang L，Villarreal OD，et al.PRMT1 loss sensitizes cells to PRMT5 inhibition[J].Nucleic Acids Res，2019，47（10）：5038-5048.DOI：10.1093/nar/gkz200.

［9］Taylor WR，Stark GR.Regulation of the G2/M transition by p53[J].Oncogene，2001，20（15）：1803-1815.DOI：10.1038/sj.onc.1204252.

［10］OConnor MJ，Thakar T，Nicolae CM，et al.PARP14 regulates cyclin D1 expression to promote cell-cycle progression[J].Oncogene，2021，40（30）：4872-4883.DOI：10.1038/s41388-021-01881-8.

［11］Yockteng-Melgar J，Shire K，Cheng AZ，et al.G（1）/S cell cycle induction by epstein-barr virus BORF2 is mediated by P53 and APOBEC3B[J].J Virol，2022，96（18）：e0066022.DOI：10.1128/jvi.00660-22.

［12］La T，Chen S，Zhao XH，et al.LncRNA LIMp27 regulates the DNA damage response through p27 in p53-defective cancer cells[J].Adv Sci （Weinh），2023，10（7）：e2204599.DOI：10.1002/advs.202204599.

（收稿日期：2023-03-08）