miR-125b在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

劉文玲，朱明明，馬德花

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是發(fā)生在漿細(xì)胞的惡性腫瘤，好發(fā)于中老年人，以骨髓中克隆性漿細(xì)胞異常增殖，分泌單克隆免疫球蛋白，合并廣泛的溶骨病變、貧血、腎功能不全、高鈣血癥為主要臨床特征[1-3]。該病發(fā)病率具有明顯的地域和人種差異，在美國(guó)，MM發(fā)病率約占血液系統(tǒng)疾病的10%[1]；在高收入國(guó)家，MM位居血液系統(tǒng)惡性腫瘤第2位，中位生存期為3～4年[2，3]。隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加快，其發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重影響中老年人的健康。MM雖然診斷以及治療水平不斷提高，但MM仍然不可治愈，并且部分患者治療后需要面臨疾病復(fù)發(fā)、進(jìn)展、耐藥的現(xiàn)狀，因此尋找可靠的、早期提示疾病惡性程度、預(yù)后的標(biāo)記物至關(guān)重要[4，5]。MicroRNAs（miRNAs）是一種短小的、保守的非編碼RNA，平均長(zhǎng)度約為19～22個(gè)核苷酸，它們以序列依賴的方式抑制翻譯或轉(zhuǎn)錄本分裂，進(jìn)而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。近年來，miRNAs在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)[6，7]，在實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，miRNA的表達(dá)特征在預(yù)測(cè)組織來源和癌癥類型方面超過了mRNA，并且在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及分化等多個(gè)方面起著重要的調(diào)控作用，其功能類似癌基因或抑癌基因[6，7]。例如，miR-15被證實(shí)抑制MM細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡[8]；miR-320a通過靶向B淋巴細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子3調(diào)控MM的細(xì)胞增殖和凋亡[9]。miR-125b作為miRNA的成員之一，是短單鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)[10]。本研究旨在分析miR-125b在MM患者中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床參數(shù)，探討上述指標(biāo)在MM中的臨床意義及價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科2020年6月-2021年8月收治的初診MM患者25例設(shè)為初診組，治療后（VRD方案化療4周期）MM療效評(píng)價(jià)達(dá)CR（IMWG療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)）的患者20例設(shè)為完全緩解組，另選取健康者15例設(shè)為對(duì)照組。初診組男13例，女12例；年齡40～76歲，平均年齡（56.46±10.58）歲。完全緩解組男9例，女11例；年齡44～78歲，平均年齡（60.00±10.58）歲。對(duì)照組男8例，女7例；年齡26～59歲，平均年齡（39.13±8.54）歲。三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件編號(hào)：P-SL-20190086），患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 總RNA提取（目錄號(hào)：DP501）、逆轉(zhuǎn)錄（KR211）、定量試劑盒（目錄號(hào)：FP411）均購(gòu)自北京天根生工公司；7900型實(shí)時(shí)定量PCR儀（購(gòu)自ABI公司），DU800型分光光度計(jì)（購(gòu)自Beckman公司），miR-125b（目錄號(hào)：CD201-0047）及內(nèi)參U6（目錄號(hào)：CD201-0145）引物設(shè)計(jì)與合成由北京天根生工公司提供。

1.3 方法 ①標(biāo)本處理：每個(gè)血液樣本置EDTA抗凝管，3000×g離心10 min，收集上清，4℃，12 000×g離心10 min，將上層血清分裝于無RNA酶的2 ml EP管中，置于-80℃保存，用于提取總RNA;②血清中總RNA的提取：具體步驟按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，測(cè)量提取物OD260/OD280比值檢測(cè)提取RNA純度，該比值1.6～1.8表示提取樣本合格，可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增；③轉(zhuǎn)錄miR-125b：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體反應(yīng)體系為RT引物工作液2 μl，無RNA酶水至11 μl混勻，RT Buffer 5 μl×5 μl，dNTP mix、RNA酶抑制劑共1.25 μl，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、無RNA酶水7.75 μl，具體操作步驟按說明書進(jìn)行；④RT-PCR檢測(cè)miRNA-125b的表達(dá)量：應(yīng)用ABI7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃，3 min；95℃，15 s；60℃，30 s；72℃，25 s；95℃，15 s；60℃，15 s，進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)，每次循環(huán)均設(shè)空白對(duì)照，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組重復(fù)3次取均值。觀察RT-PCR軟件上記錄擴(kuò)增曲線Ct值，用2-△△Ct法計(jì)算目的基因miR-125b的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析初診MM患者血清miR-125b表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系。應(yīng)用多因素Logistic回歸分析初診MM患者預(yù)后影響因素。應(yīng)用ROC曲線分析miR-125b單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)初診對(duì)MM患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 初診組中球蛋白、乳酸脫氫酶、β2微球蛋白高于完全緩解組和對(duì)照組，miR-125b表達(dá)、白蛋白水平低于完全緩解組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而完全緩解組與對(duì)照組miR-125b表達(dá)、球蛋白、乳酸脫氫酶、β2微球蛋白、白蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且三組血紅蛋白、肌酐水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較（）

表1 三組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較（）

2.2 初診患者外周血miR-125b表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 不同ISS分期及有無遺傳學(xué)突變中miR-125b表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而不同年齡、性別、M蛋白類型中miR-125b表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 初診患者外周血miR-125b表達(dá)與臨床特征的關(guān)系（）

表2 初診患者外周血miR-125b表達(dá)與臨床特征的關(guān)系（）

2.3 miR-125b與初診MM患者臨床參數(shù)的關(guān)系Pearson相關(guān)性分析顯示，初診MM患者miR-125b表達(dá)量與M蛋白、球蛋白含量、ISS分期呈負(fù)相關(guān)，而與乳酸脫氫酶、β2微球蛋白、白蛋白、血紅蛋白、肌酐、遺傳學(xué)突變均無相關(guān)性（P＞0.05），見表3。

表3 miR-125b與初診MM患者臨床參數(shù)的關(guān)系

2.4 初診MM患者預(yù)后的影響因素 以MM為因變量（否=0，是=1），將M蛋白、球蛋白、miR-125b表達(dá)水平作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示M蛋白、球蛋白及miR-125b表達(dá)水平為患者預(yù)后不佳的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表4。

表4 初診MM患者預(yù)后的影響因素

2.5 miR-125b單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MM患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線分析顯示，miR-125b聯(lián)合M蛋白、球蛋白的預(yù)后預(yù)測(cè)效能優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)，見表5、圖2。

圖2 miR-125b單獨(dú)及與M蛋白、球蛋白聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)初診MM患者預(yù)后的ROC曲線圖

表5 miR-125b單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)初診MM患者預(yù)后因素的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

近年來，臨床已經(jīng)篩選出了在MM發(fā)生過程中表達(dá)失調(diào)的miRNA，而且在逐步探索其發(fā)生機(jī)制以及對(duì)機(jī)體的影響[11]。MM細(xì)胞中miRNA的表達(dá)受多種調(diào)控機(jī)制的影響，如DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄因子、miRNA的生物學(xué)損傷以及mRNA靶基因序列的差異[12，13]。miR-125b定位于11q23，其表達(dá)失調(diào)在腫瘤的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-125b在初診的MM患者中表達(dá)下降，在治療后療效評(píng)價(jià)達(dá)到CR的患者中又較前上升，提示miR-125b在MM患者體內(nèi)的表達(dá)水平不是恒定不變的，而是隨著患者病情演變而變化，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)ISS分期Ⅲ期的患者血清中miR-125b表達(dá)水平較Ⅰ、Ⅱ期的低，提示miR-125b表達(dá)水平可能與患者病情嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。并且有遺傳學(xué)高危因素的MM患者miR-125b表達(dá)水平較沒有遺傳學(xué)高危因素的患者低，提示遺傳學(xué)改變可能是MM患者的影響因素。

另外，本研究中Pearson相關(guān)性分析顯示，初診MM患者miR-125b表達(dá)量與M蛋白、球蛋白含量、ISS分期呈負(fù)相關(guān)，提示miR-125b的表達(dá)量與MM患者腫瘤負(fù)荷有關(guān)。同時(shí)，Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，M蛋白、球蛋白及miR-125b的表達(dá)量均為影響MM患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素；并且三者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)MM的預(yù)后危險(xiǎn)因素效能優(yōu)于miR-125b的單獨(dú)檢測(cè)，提示外周血miR-125b水平對(duì)MM患者的預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)效能。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，miR-125b表達(dá)量在MM細(xì)胞系中表達(dá)下降，而MALAT1表達(dá)上調(diào)，兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞系中Notch1和HES1蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組，當(dāng)細(xì)胞系中過表達(dá)miR-125b時(shí)，發(fā)現(xiàn)MALAT1表達(dá)下降；敲減miR-125b，MALAT1水平略有升高。因此，miR-125b可能作為腫瘤抑制因子，在MM中表達(dá)下調(diào)，通過Notch1信號(hào)通路負(fù)反饋調(diào)控靶基因MALAT1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨髓瘤細(xì)胞的增殖及分化[14，15]。miR-125b還可通過改變Wnt和TGFβ信號(hào)通路之間的平衡，促進(jìn)人造血干細(xì)胞在體內(nèi)外的持續(xù)擴(kuò)增，維持造血干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)[17]，miR-125b-5P在MM各細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，并且與干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）的mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其通過直接下調(diào)IRF4及其下游效應(yīng)蛋白BLIMP-1發(fā)揮抗MM活性，導(dǎo)致了與MM凋亡、自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡。同時(shí)，miR-125b在MM免疫微環(huán)境中通過激活巨噬細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)[19，20]，miR-125b可靶向抑制P53 mRNA的表達(dá)，使p53基因促凋亡增強(qiáng)，抗凋亡表達(dá)受到抑制，并顯著增強(qiáng)地塞米松誘導(dǎo)的MM細(xì)胞死亡反應(yīng)，并通過P53/SIRT1信號(hào)通路誘導(dǎo)miR125b表達(dá)增強(qiáng)，使骨髓瘤細(xì)胞死亡。

總之，miR-125b在MM患者中表達(dá)下調(diào)，且與患者的臨床分期、遺傳學(xué)突變、球蛋白、M蛋白含量相關(guān)，其表達(dá)水平對(duì)MM患者的預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)效能。