基于雙重CRISPR-Cas12a的新型冠狀病毒核酸膠體金檢測試紙條的研制*

黃 濤,魏道舜,錢純亙,李永聰,劉仲明,李輝軍,汪大明,張 賽△

1.深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司,廣東深圳 518116;2.華中科技大學生命科學與技術學院,湖北武漢 430074;3.中國人民解放軍南部戰區總醫院醫學實驗科,廣東廣州 510010;4.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科,湖北武漢 430030;5.中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所,江蘇蘇州 215163

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于β屬的冠狀病毒,有包膜,是一種單股正鏈RNA病毒,基因組全長約30 kb,兩端為非編碼區,中間為非結構蛋白編碼區和結構蛋白編碼區。非結構蛋白編碼區主要包括開放讀碼框架(ORF)1a和1b基因,編碼16個相對保守的非結構蛋白(NSP),即NSP1-16。結構蛋白編碼區主要編碼刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白[1-2]。

對于SARS-CoV-2的核酸檢測,目前有基因測序[3-4]、數字PCR[5]和實時逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)[6-7]。RT-qPCR作為SARS-CoV-2檢測的“金標準”,對病毒核酸的檢測具有很好的靈敏度、準確度和特異度。但由于RT-qPCR需要昂貴的儀器,較高要求的實驗室環境及專業的操作人員,從而限制了它的臨床應用。近些年來,已有多種恒溫擴增方法,如重組酶聚合酶等溫擴增(RPA)[8]、酶促反應恒溫擴增(ERA)[9]及環介導等溫擴增(LAMP)[10]等,由于這些操作簡單、速度快、成本低從而得到快速的發展。

成簇規律間隔短回文重復序列(CRISPR)和相關核酸內切酶(包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b和Cas14)可在序列特異性RNA分子(gRNA)的指導下,與其特定靶點結合后表現出側向切割活性,激活的Cas核酸酶額外地切割單鏈DNA(ssDNA)[11-14]?；诤銣財U增及CRISPR/Cas的核酸檢測技術,有研究者開發了SHERLOCK系統[15]、AIOD-CRISPR[16]和DETECTR[17]系統,用于SARS-CoV-2的即時檢測。盡管SHERLOCK和DETECTR可通過側向層析試紙條進行SARS-CoV-2檢測,但從擴增到取得結果大約需要1 h。

為克服上述檢測系統的缺點,達到快速檢測SARS-CoV-2目的。本研究將RPA與CRISPR-Cas12a檢測相結合,通過設計依賴原間隔區鄰近基序位點(PAM)序列的正反雙重crRNAs來啟動高效核酸剪切。標本裂解后,既可實現雙靶點基因的恒溫擴增與雙重CRISPR檢測單管反應,又可將雙靶點基因的恒溫擴增與雙重CRISPR檢測同管同時反應,最后使用膠體金試紙條進行側向層析檢測,實現對SARS-CoV-2的現場快速檢測。現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 含SARS-CoV-2的ORF1ab部分序列和N基因全部序列的陽性質粒(深圳市亞輝生物科技股份有限公司),引物、crRNA、單鏈DNA探針[生工生物工程(上海)股份有限公司],RT-基礎型核酸擴增試劑(RAA法,杭州眾測生物科技有限公司,貨號:S003ZC),SARS-CoV-2假病毒全基因組質控品[菁良基因(深圳)科技有限公司,貨號:GW-CRBM001],超快速核酸釋放劑[RNA型,安普未來(常州)生物科技有限公司,貨號:WLD8202]。

重組酶T4 UvsX(南京巨匠生物科技有限公司,貨號:M105),重組酶輔助蛋白T4 UvsY(南京巨匠生物科技有限公司,貨號:M106),T4 gene protein 32(南京巨匠生物科技有限公司,貨號:M104),鏈置換DNA聚合酶Bsu(南京巨匠生物科技有限公司,貨號:M103),LbCas12a核酸內切酶(NEB,貨號:M0653T)。

硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維素膜(默克密理博公司),兔抗6-FAM單克隆抗體(金斯瑞生物科技股份有限公司,貨號:V90101),SA鏈霉親和素(菲鵬生物股份有限公司,貨號:SA8),羊抗兔二抗(南京京達生物技術有限公司,貨號:W4011)。

1.2方法

1.2.1引物、crRNA以及ssDNA的設計、合成與篩選 根據SARS-CoV-2 ORF1ab 基因和N基因的序列,設計了用于恒溫擴增的引物和啟動CRISPR-Cas12a的crRNA,單鏈DNA探針的5′端標記FAM熒光基團,3′端進行生物素biotin修飾。引物、crRNA、單鏈DNA探針(表1)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用陽性質粒和杭州眾測生物科技有限公司的RT-基礎型核酸擴增試劑(RAA法)進行引物篩選,具體策略:采用SYBR Green染料法將正向引物與反向引物相互搭配組合的方式進行,篩選最佳正向和反向引物對。

表1 引物、crRNAs及探針的名稱和序列

1.2.2雙重CRISPR檢測試劑反應體系建立 在引物和病毒裂解液篩選基礎上,進行配方及反應體系優化。恒溫擴增體系:50 μL反應體積中加入20 μL 2.5×A buffer(50 mmol/L pH 8.0 Tris-Ac,80 mmol/L KAc,14 mmol/L MgOAc)、6 μL B buffer(2 mmol/L DTT,5% PEG 20000,200 μmol/L dNTPs,3 mmol/L ATP,50 mmol/L磷酸肌酸)、9 μL Enzyme Mix-core(100 ng/μL CPK,1 U/μL M-MLV,0.1 U/μL RNase H,50 ng/μL Bsu DNA 聚合酶Ⅰ大片段,300 ng/μL T4 UvsX,60 ng/μL T4 UvsY,500 ng/μL T4 GP32,1 U/μL Rnasin),2 μL 10 μmol/L正向引物、2 μL 10 μmol/L反向引物、11 μL模板和RNase-free water(RNA模板加5 μL,RNase-free water加6 μL;DNA模板加1 μL,RNase-free water加10 μL),23～37 ℃條件下反應5～20 min。CRISPR檢測體系為50 μL反應體積中加入2.5 μL 20×CRISPR檢測試劑(10 mmol/L pH 7.40的Tris-HCl緩沖液,10 μmol/L LbCas12a核酸內切酶,2 mg/mL BSA),0.5 μL 1 μmol/L crRNA1/2,2.5 μL 10 μmol/L單鏈DNA探針,5 μL恒溫擴增產物,39.5 μL RNase-free water,23～37 ℃條件下反應5～20 min。

恒溫擴增與CRISPR檢測同時進行的反應體系:50 μL反應體積中加入20 μL 2.5×A buffer、6 μL B buffer、9 μL Enzyme Mix-core、2 μL 10 μmol/L正向引物、2 μL 10 μmol/L反向引物、2.5 μL 20×CRISPR檢測試劑、0.5 μL crRNA1/2、2.5 μL單鏈DNA探針、5.5 μL模板和RNase-free water(RNA模板加5 μL,RNase-free water加0.3 μL;DNA模板加1 μL,RNase-free water加4.3 μL),23～37 ℃條件下反應5～20 min。

1.2.3膠體金檢測試紙條制備 用標本墊處理液將標本墊涂布處理均勻,每張玻纖涂布量為30 mL,50 ℃烘干24 h。用偶合物稀釋液稀釋膠體金標記兔抗6-FAM單克隆抗體偶合物,體積占比為20%,用稀釋好的偶合物處理液將偶合物墊涂布處理均勻,每張玻纖涂布量為30 mL,45 ℃干燥24 h。用含0.01 mol/L pH 7.4的PBS、5%海藻糖的包被液稀釋羊抗兔二抗和SA鏈霉親和素濃度為1.0 mg/mL,分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)捕獲抗體包被在NC膜上,45 ℃烘干48 h。將制備好的標本墊、偶合物墊及NC膜依次黏貼在PVC底板上,用切條機裁切3 mm寬度。

1.2.4雙重CRISPR檢測系統評估 使用ssDNA-FB(5′-6-FAM-TTATT-3′biotin)探針在反應管中添加不同的成分進行了12個反應,1～9號管為先進行恒溫擴增后進行雙重CRISPR檢測,10～12號管為恒溫擴增與雙重CRISPR檢測同管同時進行。在37 ℃條件下反應15 min,反應結束后采用凝膠電泳進行終點檢測,同時用膠體金試紙條進行側向層析檢測。

1.2.5靈敏度分析 將SARS-CoV-2假病毒加入一定體積的RNase-free water進行復溶,并用RNase-free water分別稀釋成2 000、1 500、1 000、500 copy/mL的假病毒稀釋液。分別取上述稀釋液5 μL加入等體積的病毒裂解液混勻后,室溫裂解5 min,得到1 000、750、500、250 copy/mL的病毒裂解液,分別取1 μL進行恒溫擴增。擴增產物一部分用氯仿按1∶1粗提后進行凝膠電泳檢測,一部分搭配ssDNA-FB(5′-6-FAM-TTATT-3′biotin)探針經CRISPR酶切反應后用膠體金試紙條進行側向層析檢測。

1.2.6特異度分析 分別選用篩選獲得的基于SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的特異性引物對16種呼吸道病原體進行交叉反應性評價。將病原體原液按1∶1體積比加入病毒裂解液,室溫處理5 min。按照上述恒溫擴增條件進行反應,37 ℃反應15 min后,用膠體金試紙條進行側向層析檢測,并記錄檢測結果。

1.2.7不同溫度擴增效率分析 以SARS-CoV-2的N基因質粒為模板,在23 ℃和37 ℃條件下進行反應,分別設置反應時間為5、10、15、20 min,反應結束后進行凝膠電泳檢測,同時用膠體金試紙條進行側向層析檢測(添加ssDNA-FB探針)。

1.2.8穩定性分析 配制基于膠體金試紙條顯色的試劑,按照試劑所包含的組分分成兩組,每組8份。一組于-20 ℃及以下條件存放,一組于37 ℃條件存放。處理至第0、1、3、6、7、8天,分別取出試劑以N基因質粒為模板在37 ℃條件下反應15 min,根據檢測原理用膠體金試紙條進行側向層析檢測評估穩定性。

1.2.9臨床性能評價 用廣州萬孚生物技術股份有限公司生產的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)篩選陽性及陰性標本各30例,每個標本用本研究制備的核酸膠體金檢測試紙條測試,使用SPSS 20.0統計軟件及Kappa檢驗進行數據分析,評價所研制的核酸膠體金檢測試紙條的臨床性能。

2 結 果

2.1引物篩選 以100 ng/μL含SARS-CoV-2開放式閱讀框ORF1ab部分序列和N基因全部序列的質粒為標本進行測試。為能篩選到性能最優的基于ORF1ab基因的恒溫擴增引物,筆者將F1、F2、F3引物分別與R1、R2、R3配對組合,采用SYBR Green染料法進行引物對擴增性能的評估。結果顯示,F1R1引物對起峰時間最短,熒光信號最強,表現為擴增效率最高,見圖1A。同樣的策略,篩選得到基于N基因的最優引物組合F2R2,見圖1B。

注:A為ORF1ab基因引物擴增曲線圖;B為N基因引物擴增曲線圖。

2.2雙重CRISPR檢測系統評估 凝膠電泳檢測結果顯示,除了未加模板的1和未加恒溫擴增酶試劑的11兩個反應沒有擴增條帶以外,其余均有擴增條帶,見圖2A。其中,僅加了基于ORF1ab基因引物的2、3、4、5和僅加了N基因引物的6、7、8、9為單帶,10和12兩個反應為模糊的兩條帶。膠體金試紙條檢測結果顯示,試紙條2、3、4、6、7、8及10僅T線顯色,結果為陽性,試紙條1、5、9、11及12僅C線顯色,結果為陰性,見圖2B。以上研究結果充分說明,雙重CRISPR檢測試劑既能高效地實現先恒溫擴增再進行雙重CRISPR檢測,又可實現恒溫擴增與雙重CRISPR檢測同管同時進行。

注:A為凝膠電泳條帶結果;B為膠體金側向層析試紙條顯色結果;1表示未加模板,2表示加ORF1ab-crRNA1引物,3表示加ORF1ab-crRNA2引物,4表示同時加ORF1ab-crRNA1和ORF1ab-crRNA2引物,5表示未加ORF1ab-crRNA1和ORF1ab-crRNA2引物,6表示加N-crRNA1引物,7表示加N-crRNA2引物,8表示同時加N-crRNA1和N-crRNA2引物,9表示未加N-crRNA1和N-crRNA2引物,10表示所有試劑組分均加,11表示未加RPA恒溫擴增酶,12表示未加Cas12a核酸內切酶。

2.3靈敏度分析 凝膠電泳及膠體金試紙條結果顯示,除了無模板的對照(CK)沒有擴增條帶外,1 000 、750、500、250 copy/mL的病毒裂解液均有目標大小的凝膠電泳條帶出現(圖3A)。同時,膠體金側向層析試紙條的T線均顯色(圖3B),為陽性;而在無模板對照中C線顯色,為陰性。以上結果表明,雙重CRISPR-Cas12a檢測試劑對SARS-CoV-2假病毒的檢測靈敏度為250 copy/mL。

注:A為凝膠電泳條帶結果;B為膠體金側向層析試紙條顯色結果;M為DNA Marker,CK表示未加模板,250、500、750、1 000分別為病毒拷貝數。

2.4特異度分析 16種呼吸道病原體檢測結果均為陰性,這說明雙重CRISPR檢測試劑與本研究中提到的病原菌不會發生交叉反應,表現出很強的特異性。見表2。

表2 不同呼吸道病原體交叉反應分析

2.5不同溫度擴增效率分析 23 ℃條件下擴增反應10 min及以上時,膠體金試紙條T線顯色,當反應15 min時可以觀察到目的大小的凝膠電泳條帶。同樣,在37 ℃條件下擴增反應5 min,膠體金試紙條T線顯色,當擴增反應10 min及以上時可以觀察到目的大小的凝膠電泳條帶。擴增5 min的反應,雖凝膠電泳檢測不到條帶,但膠體金試紙條均為強陽性,這說明擴增得到的靶基因量足夠激活酶切體系中的Cas12a,實現對探針的完全切割。加上膠體金試紙條本身反應時間一般在10 min內,以上結果表明,雙重CRISPR檢測試劑在37 ℃條件下20 min內即可達到檢測SARS-CoV-2的目的。

2.6穩定性分析 試紙條于分別在-20 ℃和37 ℃條件下存放8 d,取出試劑以N基因質粒為模板在37 ℃條件下反應15 min反應后,膠體金試紙條仍呈現T線顯色C線不顯色,保持其良好的檢測效果,說明雙重CRISPR檢測試劑穩定性良好。

2.7臨床性能評價 用廣州萬孚生物技術股份有限公司生產的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)篩選陽性及陰性標本各30例,每個標本用本研究制備的核酸膠體金檢測試紙條測試,結果見表3,與萬孚SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒檢測結果比較,本研究制備的核酸膠體金檢測試紙條靈敏度為90.00%(27/30),95%CI:73.47%～97.89%;特異度為100%(30/30),95%CI:88.43%～100.00%,總符合率為95.00%(57/60),95%CI:86.08%～98.96%;Kappa檢驗一致性較好,Kappa值為0.900 0,P<0.05。

表3 臨床性能比對測試結果(n)

3 討 論

PCR核酸檢測是早期發現病原體靈敏度和特異度均高的方法,但由于常規的PCR檢測需要昂貴的核酸擴增設備和訓練有素的專業人員,而且檢測時間幾乎都在1.5 h以上,使目前的PCR技術不適合快速診斷POC應用。因此,迫切需要一種簡易的、快速且價格低廉的診斷方法。

在本研究中,筆者介紹了一種簡單、快速、高靈敏、高特異度、一體化檢測SARS-CoV-2的雙重CRISPR檢測試劑。這種檢測試劑基于SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因目標序列設計正反雙重crRNAs,可以免病毒RNA提取和純化,直接將病毒標本裂解后加入恒溫擴增試劑和CRISPR檢測試劑,將所有成分放在同一反應管中進行恒溫擴增和CRISPR檢測,實現了快捷、一體化的SARS-CoV-2病毒分子診斷,無需專業的操作人員和昂貴的核酸擴增儀器,真正意義上脫離PCR實驗室開展分子診斷。更重要的是,檢測結果可以直接通過側向層析試紙條進行肉眼觀察,整個檢測過程在20 min內就可完成,在23～37 ℃均可進行檢測。同時,該檢測試劑具有良好的熱穩定性,即使于37 ℃條件存放8 d仍具有良好的檢測效果。與已經報道的基于CRISPR的核酸檢測方法相比[17-18],這種檢測試劑無需單獨提取病毒RNA和逆轉錄獲得cDNA的步驟,等溫擴增和基于CRISPR檢測的成分都是在一個反應管中進行,完全避免了需要單獨提取病毒RNA,再逆轉錄,以及靶核酸的單獨預擴增所帶來的耗時長的缺點。

綜上所述,雙重CRISPR分析是一種快速、一體化、可恒溫擴增的核酸檢測方法,具有高特異度、高靈敏度的特點。這種簡單而穩健的方法在未來開發下一代POC分子診斷技術,并用在家庭或診所快速檢測傳染病方面具有巨大潛力。