血培養陽性標本直接快速藥敏試驗臨床應用價值評估

張渝琴,羅福康,周 麗,阮 真,朱星輝,汪曼菲

重慶市第九人民醫院檢驗科,重慶 400700

血流感染主要是病原菌(包括多種細菌、真菌和病毒)大量侵入人體血液后所引起的一種全身炎癥反應綜合征[1],嚴重者可進展為感染性休克、心力衰竭甚至死亡[2]。目前,采集患者血液進行培養仍然是菌血癥診斷的金標準[3-4]。在血培養瓶陽性報警后采用傳統檢測方法至少需要48 h才能獲得細菌鑒定與藥敏試驗結果。傳統檢測方法因檢測時間長[5],易延誤醫生對患者病情的診治,造成患者血流感染進一步惡化[6]。利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS) 技術可直接對血培養陽性標本進行快速鑒定且具有較高的準確性[7]。歐洲藥敏試驗委員會(EUCAST)在2018年發布了紙片法血培養陽性瓶直接快速藥敏試驗(RAST)的方法及折點[8],給快速藥敏試驗標準化操作和結果解讀提供了重要依據。本試驗中革蘭陰性桿菌參考 EUCAST發布的紙片法血培養陽性瓶進行RAST,革蘭陽性球菌參考2021年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)發布的M100文件中推薦對血培養陽性標本進行RAST[9]。本研究擬將血培養陽性瓶RAST與常規藥敏結果進行比對,評估血培養RAST的臨床應用價值,進一步探尋能夠為臨床血流感染提供快速、準確藥敏結果的方法,以指導臨床目標性抗感染治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年4月至2022年4月本院血培養報陽后涂片染色鏡檢為單一革蘭陰性桿菌或革蘭陽性球菌的標本,排除3 d內重復送檢為同一種細菌及混合感染的標本。

1.2儀器與試劑 BACTEC FX全自動微生物培養系統及配套血培養瓶(美國BD公司);Vitek 2 Compact 60全自動微生物鑒定和藥敏系統及配套試劑(法國生物梅里埃公司);血平板、巧克力平板、M-H瓊脂平板購自重慶龐通公司;藥敏紙片(英國Oxoid公司)。

1.3方法

1.3.1血培養陽性標本RAST

1.3.1.1革蘭陰性桿菌血培養陽性標本RAST 參照2018年EUCAST公布的紙片法血培養陽性瓶RAST方法,從涂片為單一革蘭陰性桿菌的血培養陽性培養瓶中直接抽取100～150 μL培養液至直徑90 mm的M-H瓊脂平板上,均勻涂布后貼上相應抗菌藥物紙片,藥敏紙片包括哌拉西林/他唑巴坦(36 μg/6 μg)、頭孢他啶(10 μg)、美羅培南(10 μg)、亞胺培南(10 μg)、環丙沙星(5 μg)、阿米卡星(30 μg)、慶大霉素(10 μg) 、妥布霉素(10 μg)。35 ℃培養4、6、8 h后,分別量取抑菌圈直徑,根據 EUCAST發布的不同細菌在不同時間的快速藥敏試驗的折點判讀藥敏試驗結果。本實驗室建立血培養快速藥敏方法時按照EUCAST規定進行快速藥敏試驗質控操作,且每周常規進行標準藥敏試驗方法質量控制,以保證藥敏試驗的試劑及標準化紙片擴散法的過程質量。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。根據EUCAST發布的RAST判讀標準,結果可分為敏感、耐藥和技術不定區域(ATU) 。ATU代表藥敏試驗判定結果(敏感、中介、耐藥)不確定的區域,通常為1～3 mm的抑制區直徑范圍。在此區域中,敏感、中介、耐藥的判定錯誤率較高。因此,對ATU結果不建議進行敏感性判定。

1.3.1.2革蘭陽性球菌血培養陽性標本RAST 從涂片為單一革蘭陽性球菌的血培養陽性標本中抽取100～150 μL培養液,葡萄球菌移至M-H瓊脂平板,鏈球菌移至血M-H瓊脂平板上,均勻涂布后貼上相應抗菌藥物紙片,藥敏紙片包括左氧氟沙星(5 μg)、環丙沙星(5 μg)、紅霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、四環素(30 μg)、利奈唑胺(10 μg)、萬古霉素(5 μg)、青霉素(10 U)。35 ℃培養16～24 h后量取抑菌環直徑。參考CLSI 2021 M100葡萄球菌(16～18 h,空氣)和肺炎鏈球菌(20～24 h,CO2)紙片擴散法抑菌圈折點進行藥敏結果判讀(敏感、中介、耐藥)。質控方法參照CLSI 2021 M100每周常規進行標準藥敏方法質量控制。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923、肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.3.2血培養陽性標本常規鑒定及藥敏試驗 當血培養儀提示陽性報警后,取出陽性瓶進行革蘭染色并轉種至血平板、巧克力平板,35 ℃培養18～24 h,挑選單個菌落,制備成0.5個麥氏濁度單位菌懸液。革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌均采用Vitek 2 Compact 60全自動細菌鑒定分析儀進行細菌鑒定及藥敏試驗。參照梅里埃公司給出的Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統SOP,質控頻率為每周一次。質控菌株為霍氏腸桿菌ATCC700323、嗜麥芽窄食單胞菌ATCC1766、鉛黃腸球菌ATCC700327、腐生葡萄球菌ATCCBAA750、大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.3.3藥敏結果比較 比對RAST結果與常規藥敏結果的一致性,判斷標準如下。(1)符合(CA):常規藥敏結果為敏感(或耐藥),RAST結果為敏感(或耐藥)。(2)錯誤(Er) :常規藥敏結果與RAST結果不一致。包括①嚴重錯誤(VME),假敏感,即常規藥敏結果為耐藥,RAST結果為敏感;②重大錯誤(ME),假耐藥,即常規藥敏結果為敏感,RAST結果為耐藥;③微小錯誤(mE),常規藥敏結果為中介,RAST結果為敏感或耐藥。ATU結果不判讀、不比較。

1.4統計學處理 用SPSS22.0軟件進行數據分析。計數資料以例數、百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1血培養陽性標本分離的病原菌 共收集409例血培養陽性標本,其中革蘭陰性桿菌275例(67.2%),革蘭陽性球菌134例(32.8%);標本來源于男性211例(51.6%)、女性198例(48.4%);70歲及以上患者202例(49.4%)。分離率居前3位的細菌分別為大腸埃希菌(43.5%)、凝固酶陰性葡萄球菌(15.6%)、肺炎克雷伯菌(15.2%)。見表1。

表1 血培養陽性標本分離的病原菌

2.2腸桿菌RAST結果與常規藥敏結果對比 本試驗共收集到178株大腸埃希菌并對其進行RAST。7種藥物中:4 h不可測量率最高的為哌拉西林/他唑巴坦(12.4%),最低的為美羅培南(4.5%);6 h不可測量率除哌拉西林/他唑巴坦為0.6%外,其余6種藥物均降為0.0%;8 h時全部藥物均可測量。7種藥物中4、6、8 h ATU比例最高的分別為哌拉西林/他唑巴坦(24.2%)、妥布霉素(17.4%)、妥布霉素(16.9%),最低分別為慶大霉素(3.9%)、阿米卡星(1.1%)、阿米卡星(1.1%)。6 h時7種藥物不可測量率和ATU比例均較4 h明顯下降,其中下降最明顯的是哌拉西林/他唑巴坦,6 h不可測量率較4 h下降了11.8%,ATU比例下降了14.6%,但8 h時7種藥物不可測量率和ATU比例與6 h時變化不大。 RAST結果與常規藥敏結果相比:7種藥物中4、6、8 h CA比例最高的均為慶大霉素,4、6、8 h CA比例最低的分別為哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、妥布霉素;6 h所有抗菌藥物CA比例均高于4 h,差異均有統計學意義(P<0.05),但與8 h所有抗菌藥物CA比例相比,差異無統計學意義(P>0.05);4、6、8 h VME比例最高的均為環丙沙星,分別為2.8%、3.4%、3.4%;美羅培南VME、ME、mE三者比例均為0.0%;慶大霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦這3種抗菌藥物均無VME。見表2。

表2 大腸埃希菌RAST藥敏結果與常規藥敏結果一致性比較[n或n(%)]

本試驗總共收集到62株肺炎克雷伯菌并對其進行了RAST。7種藥物中:4 h不可測量率最高的為環丙沙星(6.5%)、哌拉西林/他唑巴坦(6.5%),6 h除1株菌因生長不良無法測量外其他菌株所有藥物均可測量。7種藥物中4、6、8 h ATU比例最高的分別為哌拉西林/他唑巴坦(16.1%)、環丙沙星(8.1%)、環丙沙星(8.1%)。慶大霉素4、6、8 h均無ATU。7種藥物不可測量率和ATU比例在6 h時均較4 h時明顯下降,但在8 h時與6 h時變化不大。 RAST結果與常規藥敏結果相比:7種藥物中4、6、8 h CA比例最高的均為慶大霉素,CA比例最低的均為環丙沙星;6 h所有抗菌藥物的CA比例均高于4 h ,差異有統計學意義(P<0.05),但與8 h CA比例差異無統計學意義(P>0.05);4、6、8 h VME比例最高的均為環丙沙星;美羅培南、頭孢他啶、阿米卡星、妥布霉素這4種藥物均無VME、ME、mE。肺炎克雷伯菌4、6、8 h的藥敏結果CA比例分別為85.0%、94.2%,96.3%。見表3。

表3 肺炎克雷伯菌RAST藥敏結果與常規藥敏結果一致性比較[n或n(%)]

240株腸桿菌RAST結果與常規藥敏結果顯示,7種藥物中4、6、8 h CA比例最高的藥物為均為慶大霉素,分別為90.8%、98.3%、98.8%,僅在4 h出現了2例ME,其余判讀時間均無VME、ME、mE;4、6、8 h CA比例最低的藥物分別為哌拉西林/他唑巴坦(65.4%)、妥布霉素(80.0%)、妥布霉素(80.4%);4、6、8 h VME比例最高的均為環丙沙星,分別為2.5%、2.9%、2.9%;4、6、8 h ME比例最高的藥物均為頭孢他啶,分別為3.3%、4.6%、4.6%;4、6、8 h mE比例最高的藥物均為妥布霉素,分別為5.0%、6.3%、6.7%;4、6、8 h錯誤率最低的藥物為美羅培南,VME、ME、mE比例均為0.0%。哌拉西林/他唑巴坦在4 h不可測量率最高(10.8%)、ATU比例最高(22.1%),6 h不可測量率降至0.8%,但在7種藥物中仍是最高,8 h不可測量率降至0.0%。見表4。腸桿菌在4、6、8 h CA比例分別為78.8%、90.5%、91.5%,6 h藥敏結果CA比例優于4 h(P<0.05),與8 h果CA比例差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 腸桿菌RAST藥敏結果與常規藥敏結果一致性比較[n或n(%)]

表5 腸桿菌各判讀時間藥敏結果比較[n(%)]

另外本試驗共獲取了5株CRE,均在4 h可測量7種藥物且無ATU。RAST結果與常規藥敏結果相比:7種藥物的CA比例均為100.0%,無VME、ME、mE。見表6。

表6 CRE RAST藥敏結果與常規藥敏結果一致性比較[n或n(%)]

2.3銅綠假單胞菌RAST結果與常規藥敏結果對比 本試驗總共獲得8株銅綠假單胞菌,除1株6 h生長不良,1株頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦6 h抑菌圈邊緣模糊不可測量外,其余均可測量,在6、8 h可測量率分別為83.9%、100.0%。RAST結果與常規藥敏結果相比:環丙沙星、美羅培南、亞胺培南、慶大霉素、妥布霉素6、8 h CA比例最高,均分別為87.5%、100.0%,哌拉西林/他唑巴坦CA比例最低,僅有50.0%、62.5%;8 h所有抗菌藥物的CA比例均高于6 h ,但差異無統計學意義(P>0.05);7種藥物6、8 h 均無VME、ME、mE。見表7。銅綠假單胞菌RAST結果與常規藥敏結果相比,在6、8 h CA比例分別為80.4%、92.9%。

表7 銅綠假單胞菌RAST藥敏結果與常規藥敏結果一致性比較[n或n(%)]

2.4葡萄球菌RAST結果及與常規藥敏結果對比 本試驗總共收集到100株葡萄球菌并對其進行RAST,7種藥物在16 h均可測量,可測量率為100.0%。RAST結果與常規藥敏結果相比:CA比例最高的為利奈唑胺和青霉素,均為100.0%,最低的為克林霉素(77.0%);7種藥物均無VME,但克林霉素mE比例較高,為21.0%。葡萄球菌在16 h CA比例為90.7%,ME比例為1.3%,mE比例為8.0%,無VME。見表8。

表8 葡萄球菌RAST藥敏結果與常規藥敏結果一致性比較[n或n(%)]

2.5肺炎鏈球菌RAST結果與常規藥敏結果對比 本試驗總共收集到7株肺炎鏈球菌并對其進行RAST,6種藥物在20～24 h均可測量。RAST結果與常規藥敏結果相比:6種藥物的CA比例均為100.0%,均無VME、ME、mE。見表9。

3 討 論

血流感染的有效治療依賴于早期目標性抗感染治療,而目標性抗感染治療極大程度地依賴于及時、準確的微生物藥敏結果。隨著MALDI-TOF技術在臨床微生物領域的應用,微生物鑒定比傳統生化鑒定能夠提前24 h完成。目前,快速獲得血培養病原菌藥敏結果的方法眾多,某些學者將陽性血培養液預處理后制備成菌懸液,使用自動化儀器或紙片擴散法進行藥敏試驗[10],此法耗時相對較長,操作過程煩瑣,反復的離心、洗滌更易產生氣溶膠增加生物安全風險且無規范化折點來判斷藥敏結果;KIM等[11]用直接涂片檢查分析不同抗菌藥物條件下細菌形態的變化,可在6 h內檢測細菌的耐藥性,該方法較為復雜、煩瑣,不易常規操作;谷鈺峰等[12]將MALDI-TOF MS與FCM聯合對細菌耐藥基因進行快速檢測,可在3 h內檢測細菌藥物敏感性,但此法所需儀器價格昂貴,不適合一般實驗室推廣;還有學者利用DNA微陣列、數字PCR、二代高通量測序等分子生物學手段快速檢測細菌的耐藥基因[13],但檢測價格昂貴,不易常規檢測。2018 年11月EUCAST 發布了紙片法血培養陽性RAST方法及折點,該方法簡單、成本低、耗時短,易于實驗室常規開展及標準化,具有普遍適用性,在一定程度上可彌補上述各方法存在的缺陷。

本試驗參考EUCAST陽性血培養液RAST方法,對收集到的275株革蘭陰性桿菌進行分析。試驗發現腸桿菌在4 h時大部分抑菌圈直徑可測量,大腸埃希菌平均4 h可測量率為93.5%,肺炎克雷伯菌為94.7%略高于前者。除1株肺炎克雷伯菌因生長不良6 h無法測量外,其余239株菌株6 h均可測量,8 h 240株菌株全部可測量。這也與現有研究結果一致[14]。RAST結果與常規藥敏結果相比:大腸埃希菌4、6、8 h的藥敏結果CA比例分別為76.6%、89.2%、89.8%。肺炎克雷伯菌4、6、8 h的藥敏結果CA比例分別為85.0%、94.2%,96.3%,每個判讀時間的藥敏結果CA比例均高于大腸埃希菌。這可能與大腸埃希菌培養早期生長不良抑菌圈邊緣模糊不清被忽略有關。RAST結果與常規藥敏結果相比:本試驗腸桿菌4、6、8 h的平均藥敏結果CA比例分別為78.8%、90.5%、91.5%。腸桿菌6 h時CA比例>90%,明顯優于4 h,差異有統計學意義(P<0.05),但與8 h相比,差異無統計學意義(P>0.05),提示6 h判讀腸桿菌整體抗菌譜在準確性和時間上具有優勢。本試驗還收集到了5株CRE,均在4 h可測量全部藥物且無ATU,RAST結果與常規藥敏結果相比:CA比例均為100.0%,無VME、ME、mE。這意味著實驗室4 h可向臨床提供初步的目標性抗感染治療方案,為CRE的治療和危重癥患者的救治贏得了寶貴的時間。本試驗中的8株銅綠假單胞菌,在6、8 h可測量率分別為83.9%、100.0%,藥敏結果CA比例分別為80.4%、92.9%。雖然8 h CA比例>90%且明顯高于6 h,但8 h是否在判斷銅綠假單胞整體抗菌譜在準確性和時間上更具有優勢仍需更大量的數據支持。

本試驗結果顯示不同藥物在不同時間點判讀時不可測量率及藥敏結果CA比例有所差別。RAST結果與常規藥敏結果相比:腸桿菌CA比例最高的藥物為慶大霉素,4、6、8 h的CA比例分別為90.8%、98.3%、98.8%,僅在4 h出現了2例ME,其余判讀時間均無VME、ME、mE;VME最高的藥物為環丙沙星,4、6、8 h的VME比例分別為2.5%、2.9%、2.9%。ME最高的藥物為頭孢他啶,4、6、8 h的ME比例分別為3.3%、4.6%、4.6%。mE最高的藥物為妥布霉素,4、6、8 h的mE比例分別為5.0%、6.3%、6.7%。哌拉西林/他唑巴坦在4 h不可測量率最高10.8%,ATU最高22.1%,CA最低65.4%;6 h不可測量率降低到0.8%,ATU降至8.8%,CA上升到89.2%。哌拉西林/他唑巴坦同樣也是銅綠假單胞菌抗菌譜中不可測量率最高、ATU比例最高、CA比例最低的藥物。這可能與哌拉西林/他唑巴坦藥物ATU范圍跨度太大,導致有一部分結果落在ATU范圍內無法判讀從而降低了CA比例。本試驗中無論是腸桿菌還是非發酵菌,美羅培南錯誤率均為0.0%,即無VME、ME、mE。

本試驗100株葡萄球菌RAST折點的判讀參照CLSI 2021 M100,判斷時間為16～20 h。試驗中100株葡萄球菌整體抗菌譜在16 h均可測量,藥敏結果CA比例為90.7%,無VME,ME比例為1.3%,mE比例為8.0%。其中青霉素和利奈唑胺的CA比例均為100.0%,無VME、ME、mE。當常規藥敏試驗青霉素MIC≤0.12 μg/mL時,需進行青霉素邊緣試驗,而后再與RAST結果進行比對。本試驗中有4株葡萄球菌在進行青霉素邊緣實驗修正結果為R后與直接快速藥敏結果符合。葡萄球菌中CA比例最低,mE比例最高的均為克林霉素,比例分別為77.0%、21.0%。這可能與克林霉素RAST結果為中介的比例(21%)最高有關。中介結果中有47.6%的抑菌圈直徑為20 mm,正好在中介與敏感的折點交界處。人為的測量和判讀習慣及抑菌圈邊緣稍微不清晰都可能導致測量結果1 mm的誤差。這可能就是克林霉素中介結果判讀過多、mE比例較高的主要原因。在葡萄球菌RAST中共發現24例誘導克林霉素耐藥試驗陽性,將結果修訂為耐藥后與常規藥敏結果均符合。本試驗未將萬古霉素納入葡萄球菌RAST抗菌譜內,這也是本試驗的不足之處。根據CLSI 2021 M100要求在測定所有葡萄球菌對萬古霉素的敏感性應執行MIC法。紙片法無法區分萬古霉素敏感與中介的金黃色葡萄球菌。對于金黃色葡萄球菌外的葡萄球菌,紙片擴散法也無法區分敏感、中介、耐藥。另外,本試驗還收集到了7株肺炎鏈球菌,因生長要求比較嚴格,需在CO2環境下培養20～24 h。RAST結果顯示6種抗菌藥物在20～24 h均可測量,CA 比例均為100.0%,無VME、ME、mE。

綜上所述,血培養RAST能夠為臨床提供較為快速、準確的藥敏結果,這對于臨床血流感染治療有非常重要的指導意義[15]。腸桿菌在RAST6 h就可獲得較為準確的結果,葡萄球菌則需要16 h。耐碳青霉烯腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌則分別在RAST 4、8、20～24 h獲得較為準確的結果,CRE和肺炎鏈球菌兩者的CA比例更是達到了100.0%,但這三個時間段是否能夠成為RAST結果報告時間還需更大量的數據支持。總的來說,RAST比常規藥敏方法節省了1～2 d時間,為臨床危重癥患者的救治提供了寶貴的時間,同時臨床醫生可以將RAST結果作為參考,及時給患者使用和調整抗菌藥物,降低患者病死率和避免抗菌藥物的濫用造成細菌耐藥性的變異。