地黃除痹乳膏的質量標準研究

蘇 捷,楊賢海,付大清,馬小青,鄭光明,左小明

荊門市中醫醫院,荊門 448000

地黃除痹乳膏是由荊楚名老中醫朱必泉臨床治療痹癥的外用驗方痹痛散改變劑型而得,是荊門市中醫醫院的擬開發制劑。地黃除痹乳膏由地黃、當歸、三七、丹參、乳香、沒藥組成。方中地黃為君藥,有活血化瘀之效,廣泛應用于血熱瘀血證和外傷瘀血證的治療[1]。當歸、三七、丹參共為臣藥,具有補血活血、散瘀止痛之功效,用于治療風濕痹痛、跌打損傷[2-4]。乳香、沒藥為佐藥,能活血化瘀止痛,二者合用,可用于瘀滯痛證的治療[5]。上述諸藥合用,共奏化瘀通滯、逐痹止痛之功。因缺乏完善的質量標準,為保障地黃除痹乳膏的臨床療效,本研究用薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)對制劑中的地黃、當歸、三七進行定性鑒別。并以梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1為質量標志成分,用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography ,HPLC)測定其含量,以期有效控制地黃除痹乳膏的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1525型高效液相色譜儀、2489型紫外檢測器均購自美國Waters公司;GE0505十萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司);KQ-250B臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ZF-6三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品:梓醇(批號110808-202112,質量分數為98.8%)、毛蕊花糖苷(批號111530-201914,質量分數為95.2%)、人參皂苷Rg1(批號110703-202034,質量分數為94.0%)、人參皂苷Rb1(批號110704-202028,質量分數為93.1%)、三七皂苷R1(批號110745-201921,質量分數為90.4%)、當歸(批號120927-201617)、三七(批號120941-201810)均購自中國食品藥品檢定研究院;地黃苷D(批號MUST-21052010,質量分數為99.19%)、阿魏酸(批號MUST-21060504,質量分數為99.94%)均購自成都曼斯特生物科技有限公司;HPLC/ACS級乙腈(批號L9A0T49,河北百靈威超精細材料有限公司);色譜級磷酸(批號C1907082,阿拉丁化學試劑有限公司);硅膠G薄層板(批號20190307,青島海洋化工廠分廠);水為超純水;其他試劑均為分析純。地黃除痹乳膏(批號:20211101、20211201、20220101、20220102、20220201)及各陰性樣品由荊門市中醫醫院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 地黃、當歸、三七的定性鑒別

2.1.1地黃的TLC鑒別 取地黃除痹乳膏1 g,加20 mL體積分數為80%的甲醇溶液超聲提取15 min,過濾后蒸干濾液,加2.5 mL水溶解殘渣,用5 mL水飽和的正丁醇振搖提取3次,合并正丁醇層并蒸干,殘渣加1 mL甲醇溶解,即得供試品溶液[6-8]。另取缺地黃陰性樣品1 g同法制成陰性對照溶液。再取毛蕊花糖苷對照品約1 mg,加甲醇1 mL溶解制成對照品溶液。吸取上述溶液各5 μL,點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶0.25∶1)溶液展開,取出并晾干,于365 nm紫外光燈下觀察,見圖1。由圖1可見,供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點,陰性對照無干擾。

注:1.陰性對照溶液;2.毛蕊花糖苷對照品;3～5.供試品。

2.1.2當歸的TLC鑒別 取地黃除痹乳膏2.5 g,加乙醚30 mL,超聲15 min,過濾,蒸干濾液,加1 mL乙醇溶解殘渣,作為供試品溶液。另取缺當歸陰性樣品2.5 g、當歸對照藥材0.5 g,同法制成陰性對照溶液及對照藥材溶液。吸取上述溶液各10 μL,點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-正己烷(1∶4)溶液展開,取出并晾干,于365 nm紫外光燈下觀察[9],見圖2。由圖2可見,供試品色譜在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點,陰性對照無干擾。

注:1.陰性對照溶液;2.當歸對照藥材;3～5.供試品。

2.1.3三七的TLC鑒別 取地黃除痹乳膏2.0 g,加2 mL水混勻,加10 mL水飽和的正丁醇振搖10 min,靜置1 h后離心,取上清液,用正丁醇飽和的水溶液以3倍量混勻,靜置,取正丁醇層并蒸干,加甲醇1 mL溶解殘渣制成供試品溶液。另取缺三七陰性樣品2.0 g、三七對照藥材0.5 g,同法制成陰性對照溶液和對照藥材溶液。再取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品,加甲醇制成質量濃度均為0.25 mg·mL-1的對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL,點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水(8∶4.4∶3∶2)在10 ℃以下放置的下層溶液展開,取出晾干,以體積分數為10%的硫酸溶液噴于薄層板,于105 ℃條件下加熱至斑點清晰顯色[10-11],見圖3。由圖3可見,供試品色譜在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點,且陰性對照無干擾。

注:1.人參皂苷Rb1對照品;2.三七皂苷R1對照品;3.人參皂苷Rg1對照品;4.三七對照藥材;5～7.供試品;8.陰性對照溶液。

2.2 含量測定

2.2.1色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0～15 min,2%～10% A;15～20 min,10%～20% A;20～40 min,20%～35% A;40～45 min,35%～40% A;45～50 min,40%～2% A)。檢測波長為203 nm(梓醇、地黃苷D、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1)和316 nm(阿魏酸);柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL·min-1;進樣量為10 μL。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取梓醇對照品0.009 94 g、地黃苷D對照品0.011 98 g、阿魏酸對照品0.002 68 g、三七皂苷R1對照品0.011 77 g、人參皂苷Rg1對照品0.025 79 g、人參皂苷Rb1對照品0.022 43 g,置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到上述對照品質量濃度分別為0.196 4、0.237 6、0.053 6、0.212 8、0.484 8、0.417 6 mg·mL-1的儲備液。精密吸取儲備液2.5 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取地黃除痹乳膏及各陰性樣品2 g,置于錐形瓶中,精密加入體積分數為60%的甲醇溶液50 mL,稱定質量,加熱回流提取30 min,冷卻至室溫后稱定質量,以體積分數為60%的甲醇溶液補足減失的質量,搖勻,濾過,即得供試品溶液及各陰性對照溶液。

2.2.4系統適用性及專屬性實驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及各陰性溶液,按照2.2.1項下色譜條件進行測定,記錄色譜圖。見圖4。由圖4可見,各目標成分峰與其他雜質峰均能達到基線分離,陰性對照溶液對各目標成分的測定無干擾。

注:A.203 nm;B.316 nm。a.混合對照品溶液;b.供試品溶液;c.缺地黃陰性對照溶液;d.缺三七陰性對照溶液;e.缺當歸陰性對照溶液。1.梓醇;2.地黃苷D;3.阿魏酸;4.三七皂苷R1;5.人參皂苷Rg1;6.人參皂苷Rb1。

2.2.5線性關系考察 精密量取2.2.2項下儲備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得到6個不同質量濃度的溶液。按照2.2.1項下色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標(y)、質量濃度為橫坐標(x),進行線性回歸分析,結果見表1。

表1 各成分的回歸方程及線性范圍

2.2.6精密度實驗 精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液10 μL,按照2.2.1項下色譜條件連續測定6次,測得梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為1.13%、1.36%、0.86%、1.19%、0.98%、1.06%,表明儀器的精密度良好。

2.2.7穩定性實驗 取2.2.3項下供試品溶液,按照2.2.1項下色譜條件測定,分別于0、2、4、8、12、24 h測得溶液梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為1.81%、1.65%、1.55%、1.34%、1.29%、1.83%,表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.8重復性實驗 精密稱取2 g地黃除痹乳膏6份,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.2.1項下色譜條件進行測定,測得梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為1.64%、1.36%、1.74%、1.89%、1.51%、1.98%,表明該方法的重復性較好。

2.2.9回收率實驗 精密稱取1 g含量已知的地黃除痹乳膏6份,分別置于錐形瓶中,精密加入配制的混合對照品溶液(梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1質量濃度分別為0.452 1、0.373 6、0.032 2、0.331 5、1.057 3、0.195 1 mg·mL-1)1 mL,精密加入體積分數為60%的甲醇溶液49 mL,按照2.2.3項下方法加熱回流提取,制備供試品溶液,按照2.2.1項下色譜條件分別進樣測定,各成分的回收率見表2。

表2 地黃除痹乳膏各成分的回收率

2.2.10供試品含量的測定 精密稱取5批地黃除痹乳膏,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.2.1項下色譜條件測定,計算各成分的含量。見表3。

表3 地黃除痹乳膏各成分的含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 地黃除痹乳膏TLC鑒別藥材的選擇

地黃除痹乳膏由6味藥組成,為保證制劑質量及有效性,本研究用TLC對方中君藥地黃和臣藥當歸、三七3味藥進行定性鑒別,并進行專屬性、系統適用性考察。建立的TLC鑒別方法能準確鑒別地黃除痹乳膏中的上述3味藥。

3.2 含量測定質量標志成分的確定

地黃中含量最高的是環烯醚萜類化合物,而環烯醚萜類化合物中梓醇和地黃苷D為地黃的重要藥效成分[12-13]。當歸中有機酸類成分可作為當歸質量標志物[14],有機酸類阿魏酸為當歸補血活血的物質基礎[15]。三七的主要活性成分及主要活血成分為三七總皂苷[16],《中華人民共和國藥典》規定,三七中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總含量不得低于5.0%[11]。為確保制劑的療效穩定可靠,本研究將上述6個成分確定為地黃除痹乳膏含量測定的質量標志成分。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

本研究前期考察體積分數為45%、60%、75%的甲醇溶液的提取效果,結果顯示,在超聲處理相同時間(30 min)后,體積分數為60%的甲醇溶液提取效果最好。確定提取溶劑后,本研究還考察了超聲30、45 min與加熱回流30 min的提取效果,結果顯示,與超聲30、45 min比較,加熱回流30 min對阿魏酸和人參皂苷Rb1的提取更完全。結果表明,加熱回流30 min提取效果最優。

3.4 流動相的確定

本研究參考文獻方法[17-20],考察了1 mL·L-1磷酸溶液-甲醇與1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈為流動相的洗脫效果。結果顯示,相比于1 mL·L-1磷酸溶液-甲醇,當以1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈為流動相時,6個指標成分的保留時間均較短,且峰形佳;在低檢測波長(203 nm)條件下,鬼峰數量少,故確定1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈為流動相。

綜上所述,本研究建立的TLC能對地黃除痹乳膏中的地黃、當歸及三七進行準確鑒別,且方法簡便、可靠、專屬性強。雖未對制劑處方中的所有藥味進行定性鑒別,不能完全評價其質量,但定性鑒別的藥味中包含了君藥地黃以及相對較貴重的三七,故能夠部分評價和控制其質量。建立了新的能同時測定地黃除痹乳膏中梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量的HPLC新方法,可用于地黃除痹乳膏的質量評價。