大花肋柱花的質量標準研究

韓達斌,李維業,劉學良,劉安平,蘇 媛,汪永明,劉海青,牛貴姍,問 靜,徐文勝

1.青海省藥品審評核查中心,西寧 810007;2.西寧市食品藥品檢驗檢測中心,西寧 810007;3.三普藥業有限公司,西寧 810016

目前,大花肋柱花雖然在藏藥制劑中應用廣泛,但與同屬藥材輻狀肋柱花相比,其相關研究較少。為了保證藥材質量,本研究建立了大花肋柱花的質量控制標準,包括顯微鑒別、獐牙菜苦苷和當藥苷的薄層鑒別,并用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對大花肋柱花中的主要有效成分獐芽菜苦苷、當藥苷進行了定量分析,建立了質量控制方法,為其開發利用和質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀;Waters 2998 PDA detector型二極管陣列檢測器(美國沃特斯有限公司);ME204 梅特勒-托利多電子天平[感量0.01 mg,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];XS105DU梅特勒-托利多超越系列專業型XS分析天平(感量0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);BX43+DP26生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);SB25-12DT新芝超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Milli-Q2355超純水機(美國密理博公司)。

1.2 試藥

對照品:獐芽菜苦苷(批號110785-201404,含量為98.3%)、當藥苷(批號111742-200501,含量為99.27 %)均購自中國食品藥品檢定研究院;實驗用甲醇、乙醇均為色譜純,購自德國默克公司;磷酸為色譜純,購自上海安譜實驗科技股份有限公司;水為超純水。5批實驗用大花肋柱花經劉海青主任藥師鑒定為龍膽科肋柱花屬植物大花肋柱花Lomatogoniummacranthum(Diels et Gilg) Fern.的干燥全草。詳細信息見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

在顯微鏡下觀察大花肋柱花(編號DHLZH-001)粉末可見,綠色或粉色的色素塊隨處散在;木纖維甚多,成束散在;花粉粒較多,為圓球形或類圓形,直徑約為30 μm,有 3 個萌發孔,外壁較厚;導管多見,具螺紋、梯紋和網紋,以螺紋導管為主,單個或數個成群,排列整齊,多碎斷,直徑為8～40 μm;莖表皮細胞表面呈類長方形。木栓細胞呈長方形,壁厚。大花肋柱花粉末的顯微鑒別圖見圖1。

注:A.色素塊;B.纖維;C.花粉粒;D.螺紋導管;E.表皮細胞;F.木栓細胞。

2.2 薄層色譜鑒別

樣品溶液的制備:取本品粉末0.5 g,加甲醇25 mL,超聲處理(250 W,50 kHz)30 min,濾過,取續濾液,即得。

對照品溶液的制備:精密稱取獐牙菜苦苷對照品10 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,混勻,制成1 mg·mL-1的對照品溶液。

照薄層色譜法[2020年版《中華人民共和國藥典》,以下簡稱《中國藥典》四部通則0502]實驗,吸取上述5種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水溶液(30∶10∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,再噴以100 g·L-1硫酸乙醇溶液,加熱至斑點顯色清晰,置于紫外光燈365 nm處檢視,結果見圖2。由圖2可見,供試品色譜中,在與獐牙菜苦苷對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。

注:S.獐牙菜苦苷對照品;1～5.樣品

2.3 浸出物的測定

取各批次大花肋柱花粉末約2 g(過3號篩) ,精密稱定,以體積分數為75%的乙醇為提取溶劑,按照2020年版《中國藥典》四部(通則2201) 浸出物測定法項下的熱浸法測定。經測定大花肋柱花浸出物含量分別為29.84%、27.37%、32.47%、36.44%、33.25%,平均值為31.95%。

2.4 含量測定

2.4.1色譜條件與系統適用性實驗 Waters SunFirODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。乙腈(A)-5 mL·L-1磷酸(B)溶液為流動相,進行梯度洗脫,0～15 min,10%～15% A;15～22 min,15%～20% A;22～35 min,20%～35% A;35～40 min,35%～60% A;40～42 min,60% A;42～45 min,60%～10% A;45～50 min,10% A。流速為1.0 mL·min-1;檢測波長為254 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。在此色譜條件下,獐芽菜苦苷、當藥苷與樣品中其他成分的分離度大于1.5,理論板數不低于5 000。見圖3。

注:A.空白溶劑;B.對照品;C.供試品;1.獐芽菜苦苷;2.當藥苷。

2.4.2對照品溶液的制備 精密稱取獐芽菜苦苷對照品17.50 mg、當藥苷對照品8.11 mg,分別置于50、10 mL量瓶中,加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備溶液,再分別取2、3 mL置于25 mL量瓶中,加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得獐芽菜苦苷、當藥苷質量濃度分別為0.206 43、0.025 76 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備 取本品粉末(過3號篩)約0.2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定質量,超聲處理30 min(功率為250 W,頻率為50 kHz),取出,放至室溫,再稱定質量,用甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.4.4線性關系考察 按上述色譜條件,分別精密稱定獐芽菜苦苷、當藥苷對照品,用甲醇配制成不同質量濃度的系列混合對照溶液:獐芽菜苦苷0.121 3、 0.242 7、 0.364 0、0.485 4、 0.606 7、 0.800 8 mg·mL-1;當藥苷0.010 2、 0.025 5、 0.040 8、 0.066 2、0.081 5、 0.110 1 mg·mL-1,每次進樣10 μL,注入液相色譜儀,測得峰面積。以對照品峰面積的對數值為縱坐標(y)、對照品質量濃度為橫坐標(x),用外標兩點法計算并繪制標準曲線,進行線性回歸分析,計算回歸方程及線性范圍,計算得獐牙菜苦苷的回歸方程為y1= 807 636x1+1 319,線性范圍為0.121 3～0.800 8 mg·mL-1,r=0.999 6;當藥苷的回歸方程為y2= 1 242 369x2+ 79,線性范圍為0.010 2～0.110 1 mg·mL-1,r=0.999 4。結果表明2種成分在相應范圍內線性關系良好。

2.4.5精密度實驗 精密吸取上述2種混合對照品溶液,按2.1項下的色譜條件連續進樣6次,進樣量為10 μL,記錄峰面積。計算得獐芽菜苦苷、當藥苷峰面積的RSD值分別為0.23%、0.39%,表明儀器的精密度良好。

2.4.6穩定性實驗 取同一供試品溶液(編號DHLZH-001),按照2.1項下的色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h進行測定,進樣量均為10 μL,記錄峰面積。計算得獐芽菜苦苷、當藥苷峰面積的RSD值分別為0.38%、0.56%,表明供試品在24 h內穩定性良好。

2.4.7重復性實驗 取大花肋柱花樣品(編號DHLZH-001)6份,按照2.3項下的方法制備成供試品溶液,按照2.1項下的色譜條件進樣檢測。計算得獐芽菜苦苷、當藥苷的平均含量分別為5.421%、0.443%,其RSD值分別為0.20%、0.08%。結果表明該方法的重復性良好。

2.4.8加樣回收實驗 稱取大花肋柱花樣品(編號DHLZH-001)6份,每份0.1 g,精密稱定,置于錐形瓶中,在每組中分別加入適量獐芽菜苦苷、當藥苷對照品,按2.3項下的方法制成供試品溶液。按照2.1項下色譜條件進行分析,測定上述成分的含量,計算回收率。計算得獐芽菜苦苷、當藥苷的平均回收率分別為97.43%、98.02%,RSD值為1.87%、2.95%(n=6),表明該本方法的回收率良好。見表2。

表2 加樣回收率實驗結果(n=6)

2.4.9樣品含量測定 各批次大花肋柱花粉末各取0.2 g,精密稱定,按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖并計算各批次大花肋柱花中獐芽菜苦苷、當藥苷2種待測成分的含量。計算得5批次大花肋柱花中獐芽菜苦苷含量為5.42%～9.38%、當藥苷含量為0.44%～1.25%,見表3。

表3 樣品含量測定結果 (n=5)

3 討論

3.1 目標成分的選擇

獐芽菜苦苷、當藥苷在檢測中有很好的分離度、重復性、穩定性等,故選擇獐芽菜苦苷、當藥苷作為大花肋柱花的檢測指標來進行研究,可以有效控制該藥材的內在質量。實驗過程中還嘗試開展了大花肋柱花中馬錢苷酸、蘆丁、當藥黃素、木犀草素、槲皮素等化學成分的含量測定實驗,但由于含量較低不建議作為大花肋柱花的定量檢測指標。

3.2 色譜條件的選擇

對2種待測成分的甲醇溶液進行全波長掃描,結果顯示在254 nm處有最大吸收;實驗過程中分別對乙腈-5 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液等流動相進行考察,最終確定以乙腈-5 mL·L-1磷酸為流動相系統;實驗對系統流速、柱溫、流動相比例及不同色譜柱進行考察,最后確定流速為1.0 mL·min-1、柱溫為30 ℃、色譜柱型號為Waters SunFir ODS C18柱,在此條件下樣品含量結果的重復性好。通過對不同極性溶劑、提取方法、提取時間等因素進行考察,確定樣品提取以甲醇為溶劑、超聲處理效率最高,提取時間確定為30 min。

4 結論

本實驗對大花肋柱花進行了顯微鑒別、TLC鑒別以及醇溶性浸出物等檢查項的考察,并首次建立了用HPLC法同時測定大花肋柱花中2種主要有效成分含量的方法,并進行了方法學考察,其中顯微鑒別和TLC鑒別可以作為該藥材的定性鑒別方法,由于樣本量及藥材來源的差異性,本研究以略低于最低測定值設限,初步擬定大花肋柱花中醇溶性浸出物的含量不得少于 25.0%,獐芽菜苦苷、當藥苷2種待測成分的含量分別不少于5.0%、0.4%。該方法簡便、高效、準確,可用于大花肋柱花的質量控制。本法為全面評估大花肋柱花的質量和新藥研究、開發提供了一定的參考。