羅格列酮通過激活Nrf2信號通路及抑制NLRP3炎癥小體的活化發揮對急性肝損傷的保護作用

馬 玲,馬 明,麻斌喜,陳偉嵐,周衛剛,蔣 文,楊 麗,蔣 利*

1.新疆醫科大學第八附屬醫院,烏魯木齊 830049; 2.新疆維吾爾自治區人民醫院,烏魯木齊 830001

自身免疫異常、病毒、藥物、毒物、感染及創傷等因素均易造成肝損傷,嚴重的肝損傷若不能有效控制極易發展為急性肝功能衰竭,不可逆地影響正常肝功能,甚至危及生命,病死率高達80%[1]。四氯化碳(CCl4)是一種化學性肝臟毒性物質,通過細胞色素P4502E1(CYP2E1)的代謝活化誘導肝細胞損傷[2]。CCl4也可促使肝細胞分泌大量的炎癥因子,可觸發代謝形成自由基而導致肝細胞膜脂質過氧化產物的產生,從而促進肝細胞凋亡和壞死,最終誘發肝損傷[3]。目前,CCl4作為誘導劑用于建立肝損傷研究模型已得到廣泛應用[4]。目前臨床上用于治療肝損傷的方法包括立即停用引起肝臟損傷的藥物以及給予具有抗炎、抗自由基、促進肝細胞修復和再生的藥物,但針對肝損傷仍缺乏特異、有效的治療策略,因此肝損傷的基礎研究和臨床治療仍然是研究的熱點[5]。羅格列酮(rosiglitazone,RSG)是一種胰島素增敏劑,可增加骨骼肌、肝臟等組織中胰島素的敏感性,提高葡萄糖的利用率,是臨床上常用的2型糖尿病降糖藥物[6]。已有研究[7-8]顯示,羅格列酮可通過抗感染和抗氧化作用拮抗由對乙酰氨基酚引起的藥物性肝損傷以及通過抑制肝臟激活子蛋白-1信號和NADPH 氧化酶、調控抗氧化酶,減輕脂多糖暴露所致小鼠的急性肝損傷。本研究使用CCl4誘導小鼠急性肝損傷,探討羅格列酮是否通過激活核因子E2相關因子2(nuclear factorery throid-2 related factor2,Nrf2)信號通路及抑制NOD-like受體蛋白(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體的活化發揮對急性肝損傷的保護作用,為肝損傷的治療提供新的方向。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Fresco17型高速冷凍離心機、Multiskan FC型酶標儀和ABI 7500 快速實時熒光定量PCR儀,均購自美國Thermo Fisher Scientific, Inc.公司;IX-70 熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);蛋白質印跡法(Western blotting)電泳儀、電轉儀和蛋白質免疫印跡系統,均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 試藥

羅格列酮片(國藥準字H20041422,成都恒瑞制藥有限公司);CCl4(上海國藥化學試劑有限公司),臨用前將1 mL CCl4溶于100 mL橄欖油中,并充分混合,制備體積分數為1%的 CCl4溶液;蘇木素-伊紅染液(HE,北京索萊寶科技有限公司);丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartic transaminase,AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和BCA蛋白測定試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和TRIzol試劑,均購自Thermo Fisher Scientific, Inc.公司;PrimeScript 逆轉錄試劑盒(日本Takara Bio, Inc.公司);QuantiTect SYBRGreenPCR試劑盒(Chiagen, Inc.公司);RIPA裂解緩沖液(碧云天生物技術研究所);Nrf2、NADPH醌氧化還原酶-1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO-1)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、IL-1β、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、β-actin和辣根過氧化物酶標記兔抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG),均購自美國Abcam公司;電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)試劑(美國Millipore Sigma公司)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠40只,體質量為18～22 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號為SCXK(京)2021-0011。實驗開始前適應性飼養1周。環境溫度為25 ℃,相對濕度為55%,光照/黑暗周期為12 h,小鼠可自由獲取食物和水。本研究獲新疆醫科大學第八附屬醫院倫理委員會批準(批準編號2020-035),遵循3R原則進行相關操作。

2 方法

2.1 動物分組、給藥和建模

將40只KM小鼠隨機分為正常對照組、正常治療組、CCl4模型對照組和CCl4模型治療組,每組10只。各組小鼠連續灌胃給藥5 d,正常治療組和CCl4模型治療組灌胃給予羅格列酮10 mg·kg-1,正常對照組和CCl4模型治療組小鼠給予同體積純凈水。末次給藥1 h后CCl4模型對照組和CCl4模型治療組小鼠腹腔注射體積分數為1%的 CCl4(10 mL·kg-1),正常對照組和正常治療組小鼠腹腔注射橄欖油(10 mL·kg-1)。所有小鼠造模后24 h內禁食,僅自由飲水,然后進行后續實驗。

2.2 血清生化指標和炎癥因子的測定

各組小鼠造模24 h后使用戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)進行麻醉,然后沿著腹部中線切開打開腹腔,暴露腹主動脈,用注射器采血后置于采血管中,于4 ℃下靜置30 min,以2 000 r·min-1離心10 min,分離得血清。用比色法測定血清ALT和AST水平,用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平。以上操作均嚴格按照說明書進行。

2.3 肝組織病理學觀察

各組小鼠腹主動脈采血完畢后通過頸椎脫位處死小鼠,分離獲得肝組織,用PBS洗滌,肝中葉、肝右前葉和肝右后葉于-80 ℃保存,用于后續實驗,肝左外側葉置于40 mL·L-1多聚甲醛中4 ℃固定6 h,用梯度乙醇脫水,常規石蠟包埋,將組織樣品切成5 μm厚的切片,在室溫下用蘇木精染色3 min后,用伊紅染色3 min,用梯度乙醇脫水后用伊紅染色30 s,在二甲苯中透明3 min。在光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

2.4 肝組織氧化應激指標的檢測

根據以下公式計算用于測量肝功能指數的組織樣本質量:組織質量(g)∶體積(mL)= 1∶9。將肝中葉組織樣品加入預冷的生理鹽水中,并在冰上勻漿。于4 ℃下以3 000 r·min-1離心勻漿10 min,收集上清液。按照試劑盒說明書測定肝組織中SOD、CAT、GSH和MDA的含量。

2.5 定量逆轉錄聚合酶鏈反應

取出-80 ℃保存的待測肝臟右前葉,用濾紙吸干標本的水分,用眼科剪將心肌組織剪碎后,加入Trizol試劑提取總RNA。用全自動酶標儀檢測RNA的質量分數,控制260、280 nm處的吸光度值比值范圍為1.8～2.0。用PrimeScript逆轉錄試劑盒進行RNA的逆轉錄得cDNA。以cDNA為模板,使用QuantiTect SYBRGreen PCR試劑盒進行定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)擴增。qRT-PCR條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性30 s,64 ℃退火34 s,72 ℃ 30 s,反應40個循環,72 ℃延展5 min。以GAPDH作為內參,用2-ΔΔCt法計算目標基因TNF-α、IL-6、IL-1β、Nrf2、NQO-1和HO-1的相對表達量。

2.6 蛋白質印跡分析

取出-80 ℃保存的待測肝臟右后葉,用濾紙吸干標本的水分,用眼科剪將心肌組織剪碎后,用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白含量。用100 g·L-1SDS-PAGE分離總蛋白提取物(20 μg·泳道-1),然后轉移至PVDF膜上。在室溫下用50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h后,洗膜,加入一抗,4 ℃過夜,洗膜,加入二抗,在37 ℃下持續2 h。在室溫下用ECL試劑顯影2 min,用Image J圖像分析軟件對各蛋白條帶進行灰度值測定。以β-actin為內參,計算目標蛋白Nrf2、NQO-1、HO-1、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的相對表達量。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織病理學的影響

正常對照組和正常治療組小鼠的肝細胞形態正常,呈放射狀緊密排列,未見肝細胞變性、壞死;CCl4模型組小鼠肝細胞排列紊亂,可見炎性細胞浸潤及肝細胞壞死;而CCl4模型治療組小鼠的肝細胞排列較CCl4模型組緊密,炎性細胞浸潤及肝細胞壞死減少。見圖1。

注:A.正常對照組;B.正常治療組;C.CCl4對照組;D.CCl4模型治療組。

3.2 羅格列酮對急性肝損傷小鼠血清肝功能指標的影響

正常對照組和正常治療組小鼠的血清ALT和AST水平比較差異無統計學意義(P>0.05),CCl4模型組小鼠的血清ALT和AST水平較正常對照組顯著升高(P<0.05),CCl4模型治療組小鼠的血清ALT和AST水平較CCl4模型組小鼠顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 羅格列酮對急性肝損傷小鼠血清肝功能指標的影響 (n=10)

3.3 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織氧化應激指標的影響

正常對照組和正常治療組小鼠肝組織SOD、CAT、GSH和MDA水平比較差異無統計學意義(P>0.05);CCl4模型組小鼠肝組織SOD、CAT和GSH水平較正常對照組小鼠顯著降低(P<0.05),MDA水平較正常對照組小鼠顯著升高(P<0.05);CCl4模型治療組小鼠肝組織SOD、CAT和GSH水平較CCl4模型組小鼠顯著升高(P<0.05),MDA水平較CCl4模型組小鼠顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織氧化應激指標的影響 (n=10)

3.4 羅格列酮對急性肝損傷小鼠血清炎癥因子水平的影響

正常對照組和正常治療組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較差異無統計學意義(P>0.05),CCl4模型組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平較正常對照組顯著升高(P<0.05),CCl4模型治療組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平較CCl4模型組小鼠顯著降低(P<0.05),見表3。

表3 羅格列酮對急性肝損傷小鼠血清炎癥因子水平的影響 (n=10)

3.5 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織相關基因表達的影響

正常對照組和正常治療組小鼠肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β、Nrf2、NQO-1和HO-1 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05);CCl4模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達水平較正常對照組小鼠顯著降低(P<0.05),Nrf2、NQO-1和HO-1 mRNA表達水平較正常對照組小鼠顯著升高(P<0.05);CCl4模型治療組小鼠肝組織TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達水平較CCl4模型組小鼠顯著升高(P<0.05),Nrf2、NQO-1和HO-1 mRNA表達水平較CCl4模型組小鼠顯著升高(P<0.05),見表4。

表4 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織相關基因表達的影響(n=10)

3.6 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織Nrf2信號通路相關蛋白的影響

正常對照組和正常治療組小鼠肝臟組織Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),CCl4模型組小鼠肝臟組織Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達水平較正常對照組顯著降低(P<0.05),CCl4模型治療組小鼠肝臟組織Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達水平均較CCl4模型組小鼠顯著升高(P<0.05),見表5、圖2。

表5 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織Nrf2信號通路相關蛋白的影響 (n=10)

注:1.正常對照組;2.正常治療組;3.CCl4模型組;4.CCl4模型治療組。

3.7 羅格列酮對急性肝損傷小鼠肝組織NLRP3信號通路相關蛋白表達的影響

正常治療組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達水平均較正常對照組小鼠顯著降低(P>0.05),CCl4模型組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達水平均較正常對照組顯著升高(P<0.05),CCl4模型治療組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達水平均較CCl4模型組小鼠顯著降低(P<0.05),見表6、圖3。

4 討論

肝臟是機體中最大的實質臟器,主要發揮消化、吸收、代謝和營養物質儲存等作用。肝臟的結構、功能復雜,自身免疫異常、病毒、藥物、毒物、感染及創傷等均可導致肝損傷。

CCl4主要作用于肝臟,為常見的肝毒性化合物,CCl4可通過直接或間接刺激肝細胞導致肝細胞損傷,與臨床上發生的急性肝損傷非常相似[9]。因此,本研究用CCl4建立肝損傷小鼠模型,模型組小鼠肝細胞排列紊亂,可見炎性細胞浸潤及肝細胞壞死,并且血清ALT和AST水平顯著升高。ALT和AST是在氨基酸代謝中發揮重要作用的2種酶,廣泛存在于肝細胞中,當炎癥、壞死或中毒介導肝細胞損傷后可改變肝細胞膜的通透性,肝細胞中ALT和AST溢出進入血液循環[10]。因此,血清AST和ALT水平是臨床判斷肝損傷程度的重要指標,AST和ALT水平與肝損傷程度呈正相關,二者也是反映肝損傷的敏感指標[11]。模型小鼠經羅格列酮治療后,肝細胞排列緊密,炎性細胞浸潤及肝細胞壞死減少,并且AST和ALT水平顯著降低,表明羅格列酮對CCl4誘導肝損傷小鼠模型具有較好的治療作用。

目前,抑制氧化應激和炎癥被認為是治療肝損傷的重要策略[12]。體內氧自由基清除不足或產生過多,可使肝細胞膜、溶酶體膜等發生脂質過氧化反應,生成脂質過氧化終產物MDA,可破壞細胞膜結構和功能的完整性[13]。SOD和CAT是肝臟中重要的抗氧化酶,對維持肝細胞膜結構的穩定和功能的完整、消除自由基及提高肝臟解毒能力具有重要意義[14]。此外,GSH是一種由3種氨基酸組成的小肽,可將自由基轉化為酸性物質,從而加速自由基的排泄。本研究結果顯示,模型小鼠經羅格列酮治療后肝組織SOD、CAT和GSH水平顯著升高,MDA水平顯著降低,表明羅格列酮可顯著減輕CCl4誘導肝損傷小鼠模型體內的氧化應激反應。

Nrf2是調節細胞抗氧化應激反應并激活內源性抗氧化反應的關鍵轉錄因子,由紅細胞衍生核因子2樣蛋白2編碼,屬于堿性亮氨酸轉錄因子家族。正常條件下Nrf2表達水平較低,這主要是由于Nrf2被Kelch樣ECH關聯蛋白1(KEAP1)介導的蛋白酶體降解[15]。在氧化應激條件下,Nrf2基因被激活,與磷酸化的KEAP1解離,激活下游的抗氧化基因和蛋白的表達,如HO-1、NQO-1及其他抗氧化酶。HO-1是一種催化血紅素代謝的限速酶,可以抑制肝臟組織中丙二醛的形成,降低脂質過氧化,增加肝臟超氧化物歧化酶的生成,對氧化應激具有負調節作用,使機體免受活性氧的侵害[16]。NQO-1是一種抗氧化酶,通過單步雙電子還原反應催化醌還原成氫醌,促進醌的排泄,以減少機體中活性氧的形成,從而阻止有害物質對DNA造成氧化損傷[17]。因此,激活的Nrf2信號通路可以發揮抗氧化應激作用,使機體保持氧化還原穩態,從而保護肝臟免受多種氧化應激誘導的損傷。本研究結果顯示,模型小鼠經羅格列酮治療后肝組織Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA和蛋白的表達水平顯著升高,表明羅格列酮可通過激活Nrf2信號通路激活下游HO-1、NQO-1 mRNA和蛋白的表達,從而降低CCl4誘導肝損傷小鼠模型體內的氧化應激反應。

多數肝損傷的病理進程都伴隨炎癥反應的發生,肝臟氧化應激與炎癥的發生密切相關。氧化應激能夠激活機體的庫普弗細胞,釋放出大量的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等,而這些促炎因子能作用于內皮細胞、肝星狀細胞和肝細胞,隨后募集免疫細胞從而引發炎癥反應[18]。本研究結果顯示,模型小鼠經羅格列酮治療后血清TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平顯著降低,肝臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平顯著降低,表明羅格列酮可顯著減輕CCl4誘導肝損傷小鼠模型體內的炎癥反應。

NLRP3炎癥小體是迄今為止研究最多、最廣泛的炎癥小體,是由識別炎癥的核心蛋白NLRP3蛋白、ASC和效應分子caspase-1組成的[19]。當NLRP3炎癥小體被活化時,NLRP3蛋白發生寡聚化使N端吡啶結構域發生聚合,招募ASC,二者相互作用進一步招募激活pro-caspase-1,pro-caspase-1 誘導自身蛋白水解為具有酶活性的異二聚體caspase-1。caspase-1能夠引起促炎細胞因子IL-1β和IL-18 前體的成熟活化,使其成為有致炎作用的炎癥因子IL-1β和IL-18,并釋放至細胞外,進一步啟動下游信號通路,最終介導炎癥反應的發生[20]。已有研究表明NLRP3在肝臟炎癥和纖維化的調節中發揮關鍵作用[21],并且NLRP3信號轉導的激活在急性肝損傷中發揮重要作用[22]。本研究結果表明,模型小鼠經羅格列酮治療后肝組織NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表達水平顯著降低,表明羅格列酮可通過抑制NLRP3炎癥小體的活化從而減輕CCl4誘導肝損傷小鼠模型體內的炎癥反應。

總之,羅格列酮通過激活Nrf2信號通路抑制氧化應激反應以及通過抑制NLRP3炎癥小體活化抑制炎癥反應從而對CCl4誘導的小鼠肝損傷產生保護作用。