牛蒡子苷通過ROS/PI3K/Akt/mTOR通路調控宮頸癌細胞的研究

楊 衛(wèi),李媛媛,張麗柯,丁 巖

1.南陽市第一人民醫(yī)院河南省腫瘤分子生物學醫(yī)學重點實驗室,南陽 473001; 2.南陽市第一人民醫(yī)院放射腫瘤科,南陽 473000

宮頸癌按照組織形態(tài),可分為宮頸鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗癌等,其中有兩類最為常見,分別是鱗狀細胞癌和腺癌,約占宮頸癌的95%[1]。牛蒡子苷(arctiin,ARC)是提取自傳統(tǒng)中藥牛蒡子的有效活性成分之一,具有疏風解熱、祛瘀解毒等功效[2],可發(fā)揮抗炎、抗腫瘤等藥理活性[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)ARC對結腸癌、胃癌、鼻咽癌等惡性腫瘤均具有較好的抗腫瘤活性[6]。本研究旨在探討ARC對宮頸癌細胞的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YT-CJ-2NB型超凈工作臺(北京亞泰隆醫(yī)療器械公司);MB-530型多功能酶標分析儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 試藥

牛蒡子苷(ARC,質量分數(shù)為98%,批號A25101,規(guī)格為20 mg,上海吉至生化科技有限公司);3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)自噬抑制劑(批號R004697,上海易恩化學技術有限公司);兔抗β-actin(批號K200058M)、兔抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K,批號IM0190)、蛋白激酶B(protein kenase B,Akt,批號K004047P)、哺乳動物雷帕霉菌靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR,批號IR0010)、哺乳動物ATG6同源蛋白(mammalian ATG6 homologous protein,Beclin-1,批號ASK-001)、微管相關蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B,批號K008014P)一抗及山羊抗兔二抗免疫球蛋白-G(immunoglobulin G,IgG,批號SE134),均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細胞

人宮頸癌細胞株HeLa購于中國科學院上海細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細胞增殖

將HeLa細胞常規(guī)培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中(質量分數(shù)為10%的胎牛血清和質量分數(shù)為1%的青霉素-鏈霉素)。取對數(shù)期細胞接種于96孔板中,每孔約1×105個細胞,分別給予終濃度為0、10、20、40、80 μmol·L-1ARC,在37 ℃、體積分數(shù)為5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,孵育4 h,酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度(A)值,以篩選最佳濃度。

2.2 細胞分組

將HeLa細胞隨機分為對照組、ARC組和ARC聯(lián)合3-MA組。顯微鏡下確認細胞生長良好且密度適宜即可開始干預,ARC組給予40 μmol·L-1ARC培養(yǎng)液進行干預,ARC聯(lián)合3-MA組給予含有40 μmol·L-1ARC和5 mmol·L-13-MA的培養(yǎng)液進行干預,對照組給予等量完全培養(yǎng)液。

2.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率

2.5 g·L-1胰蛋白酶消化各組細胞,調整細胞密度為1×105個·mL-1,將細胞接種于96孔板中,每孔100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。另設空白組(僅含培養(yǎng)液),CCK-8法檢測細胞增殖情況(同2.1項)。細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%。設置5個復孔。

2.4 DCFH-DA法檢測細胞活性氧(reactive oxygen species ,ROS)水平

取對數(shù)期細胞,用胰蛋白酶消化,按1×105個·mL-1接種于6孔板中,加入對應藥物放入37 ℃、體積分數(shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PBS清洗細胞,加入配制好的DCFH-DA溶液5 μmol·L-1,孵育1 h。PBS重懸,上機檢測,于488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長處進行檢測。于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況并拍照。

2.5 透射電子顯微鏡觀察自噬小體

取對數(shù)期細胞,用胰蛋白酶消化后制成細胞懸液(1×105個·mL-1),加入對應藥物放入37 ℃、體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細胞固定于戊二醛中,用切片機制成玻片,滴加檸檬酸鉛進行染色,用透射電鏡進行觀察。

2.6 RT-PCR檢測mRNA表達水平

取各組細胞,用TRIZOL法提取總RNA,逆轉錄合成cDNA。配制反應體系:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA樣品2 μL,RNase Free ddH2O 6 μL,進行擴增。95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40次。以β-actin作為內參,2-△△CT法計算各樣本之間基因表達差異。引物設計為PI3K-F(5′-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3′)、PI3K-R:(5′-GGCTACAGTAGTGGGCTTGG-3′);Akt-F:(5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′)、Akt-R:(5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′);mTOR-F:(5′-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3′)、mTOR-R:(5′-GCTGGTCATAGAAGCGAGTAGAC-3′);β-actin-F:(5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′)、β-actin-R:(5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′)。

2.7 蛋白質印跡法(Western Blotting)檢測蛋白表達水平

取各組細胞,消化離心后接種于6孔板中培養(yǎng),待細胞貼壁后加入對應藥物進行干預。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,加入RIPA裂解液100 μL于冰上裂解,提取總蛋白。加入配制好的BCA顯色液,用BCA法(bicinchoninic acid assay)檢測蛋白濃度,統(tǒng)一蛋白上樣量40 μg,進行凝膠電泳,轉至PDVF膜上,封閉液(5 g·L-1脫脂奶粉)封閉2 h,加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,漂洗,加入二抗(1∶2 000)封閉2 h,ECL顯影成像,凝膠成像分析儀采集圖像,Image J軟件分析結果。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 ARC對細胞增殖能力的影響

不同濃度ARC作用于人宮頸癌HeLa細胞48 h后,各組細胞的增殖能力均明顯降低。與0 μmol·L-1ARC組比較,10、20、40、80 μmol·L-1ARC組細胞增殖能力降低(P<0.05)。ARC作用于HeLa細胞48 h的IC50約為40 μmol·L-1,所以后續(xù)實驗以40 μmol·L-1為統(tǒng)一給藥濃度。見表1。

表1 各組細胞增殖能力的比較 n=3)

3.2 各組細胞增殖抑制率的比較

與24 h比較,48 h后ARC組、ARC聯(lián)合3-MA組的細胞增殖抑制率升高(P<0.05)。與ARC組比較,干預24 h后,ARC聯(lián)合3-MA組的細胞增殖抑制率降低(P<0.05)。干預48 h后,ARC聯(lián)合3-MA組的細胞增殖抑制率降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率的比較

3.3 各組細胞ROS水平的比較

DCFH-DA實驗結果顯示,與對照組比較,ARC組細胞ROS水平明顯降低(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細胞ROS水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞ROS水平的比較

3.4 透射電鏡觀察自噬小體

用透射電鏡觀察各組細胞自噬小體的形態(tài)。對照組細胞可見正常長條形線粒體結構,且脊結構清晰;與對照組比較,ARC組細胞可觀察到含有細胞內容物的雙層膜結構的自噬小體,且呈聚集狀態(tài),展現(xiàn)自噬的發(fā)生過程,其線粒體脊結構模糊,呈破碎狀;ARC聯(lián)合3-MA組細胞自噬小體的數(shù)量明顯降低,未出現(xiàn)自噬小體聚集現(xiàn)象,線粒體結構清晰。見圖1。

3.5 PI3K/Akt/mTOR mRNA水平的比較

結果顯示,與對照組比較,ARC組細胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表達水平明顯降低(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細胞PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達水平明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組宮頸癌細胞PI3K/Akt/mTOR mRNA水平的比較

3.6 PI3K/Akt/mTOR蛋白水平的比較

與對照組比較,ARC組細胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組宮頸癌細胞PI3K/Akt/mTOR蛋白水平的比較

3.7 自噬蛋白水平的比較

與對照組比較,ARC組細胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)。見表6。

表6 各組宮頸癌細胞自噬蛋白水平的比較

4 討論

宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展相對緩慢,從HPV感染到宮頸癌一般需要經歷4個階段,分別是HPV感染、持續(xù)性的病毒感染引起宮頸細胞上皮細胞產生病變、宮頸癌上皮細胞發(fā)生癌前病變和宮頸浸潤癌[7-8]。

牛蒡子含有多種生物活性成分,其主要成分包括揮發(fā)油、油脂類、木脂素類和生物堿,具有藥用價值的ARC就屬于提取自牛蒡子的木脂素類[9-10]。ARC在抑制腫瘤方面具有良好作用,可通過抑制腫瘤惡性增殖、增強腫瘤對化療藥物的敏感性和減少腫瘤新生血管生成抑制腫瘤的發(fā)展[11-13]。

本研究用不同濃度ARC處理體外培養(yǎng)的人宮頸癌細胞HeLa,篩選出合適的作用濃度,進一步探討ARC對宮頸癌細胞惡性增殖的影響。結果顯示,用不同濃度ARC作用于HeLa細胞時,細胞增殖活性隨ARC濃度升高而逐漸降低,以80 μmol·L-1ARC對HeLa細胞增殖能力的抑制作用最為明顯,半數(shù)抑制濃度IC50為40 μmol·L-1。表明不同濃度ARC能夠顯著抑制宮頸癌細胞增殖能力,降低腫瘤生長活性。用ARC聯(lián)合自噬抑制劑3-MA后表現(xiàn)出細胞增殖抑制率降低,表明自噬抑制劑的添加影響了ARC對宮頸癌細胞增殖的抑制作用。在檢測細胞ROS水平時發(fā)現(xiàn),用ARC處理可以大幅度降低細胞的ROS水平,但這一作用在添加了3-MA后呈降低趨勢,進一步驗證ARC對宮頸癌細胞的抑制作用與細胞自噬水平有關。

自噬可促進腫瘤細胞死亡,為其他生理活動提供能量,PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路是調節(jié)細胞自噬水平的主要通路[14-15]。自噬標志蛋白Beclin-1在腫瘤細胞中的表達量明顯下降,可見高水平的細胞自噬可以抑制腫瘤的發(fā)展[16-17]。在本研究中,用ARC處理的細胞PI3K、Akt、mTOR mRNA表達水平及PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平均呈降低趨勢,同時發(fā)現(xiàn)自噬標志蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平也顯著升高。Beclin-1作為自噬水平的負調控因子,高度參與細胞自噬水平的調控過程[18-20]。表明ARC能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,調節(jié)細胞自噬水平,結合自噬標志蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表達水平的升高,細胞自噬水平升高,抑制腫瘤細胞增殖,而這一趨勢在添加3-MA后受到抑制,證實ARC通過影響PI3K/Akt/mTOR信號通路活性調節(jié)細胞自噬水平。

綜上所述,ARC對人宮頸癌細胞HeLa的惡性增殖有一定的抑制作用,并能提高宮頸癌細胞自噬水平,可能是通過調節(jié)細胞ROS水平、影響ROS/PI3K/Akt/mTOR信號通路發(fā)揮作用的。