響應面法優化草烏甲素納米乳的制備工藝

何雨曉,李麗云,孫文強,丁江生*,周云龍

1.云南中醫藥大學,昆明 650500;2.云南省藥物研究所,昆明 650111;3.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室,昆明 650111

草烏甲素是從毛莨科烏頭屬植物滇西嘟拉(A-conitumbulleyanumDiels)中分離出的生物堿——滇西嘟拉堿甲(bulleyaconitine A),屬于二萜雙酯型生物堿,是一種強效鎮痛劑和抗炎劑,在臨床上有廣泛的治療效果,可用于治療由各種原因導致的慢性疼痛、癌性疼痛、頸肩痛、腰腿痛等[1-4]。國家食品藥品監督管理局批準的制劑類型有片劑、口服液、注射劑和膠丸劑。現有的給藥方式仍存在一些問題,如草烏甲素對黏膜、肌肉等組織具有較強的刺激性,注射時局部會長時間劇烈疼痛,口服時胃腸道不良反應較明顯;草烏甲素是雙酯型生物堿,有毒并且治療窗較窄,生物半衰期短,而目前的制劑都是速釋制劑,血藥濃度波動比較大,無法保證用藥的安全性和有效性[5]。

納米乳是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例混和而自發形成的膠體分散體系,既具親脂性又具親水性,與角質層的細胞間脂質雙分子層有較高的相容性,可穿透角質層進入體循環而發揮全身治療作用[6-7]。納米乳作為經皮給藥載體,可顯著增加難溶性藥物的溶解度,大大加快藥物的透皮速度。納米乳可作為經皮給藥的載體,用于治療各種疾病,如阿爾茨海默病、帕金森病、骨質疏松癥、類風濕關節炎等[8]。此外,納米乳液滴的結構特殊,使經皮給藥后藥物釋放的時間更長、血藥濃度更加平穩[9]。Box-Behnken響應面法是將多項式方程與實驗數據擬合結合的一種方法,與傳統優化分析相比,Box-Behnken響應面法具有用較簡單的實驗就能確定研究的自變量與因變量之間相互作用的優點[10-11]。因此,與傳統的優化分析相比,其使用的試劑和材料更少,并且節省時間[12-13]。

本實驗用加水滴定法和微流化均質制備草烏甲素納米乳,以單因素考察結合Box-Behnken響應面法優化草烏甲素納米乳的處方,并對其粒徑分布、穩定性和體外透皮性能進行評價,為草烏甲素制劑的研發提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PL203型電子天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司];STX1202ZH型電子天平(奧豪斯儀器有限公司);1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);TF2RJ-100-DLZS-SB-ZJD61型真空乳化攪拌機(溫州天富機械有限公司);MS-H280-Pro型磁力攪拌器[亞速旺(上海)商貿有限公司];NANO型微射流均質機(諾澤流體科技有限公司);BIC 90 Plus型激光粒度儀(美國布魯克海文儀器公司);JEM2100型透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.2 試藥

草烏甲素對照品(中國食品藥品檢定研究院);草烏甲素(云南淶文生物科技有限公司);中鏈三酰甘油(MCT油,青島海智源生命科技有限公司);油酸(山西晉湘輔料有限公司);聚氧乙烯40氫化蓖麻油(RH-40)、蓖麻油聚烴氧酯35(HEL-35),均購自北京鳳禮精求醫藥股份有限公司;辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)、二乙二醇單乙醚(transcutol P),均購自嘉法獅(上海)貿易有限公司。

2 方法

2.1 草烏甲素在輔料中平衡溶解度測定的方法學考察

2.1.1草烏甲素對照品溶液的制備 精密稱量草烏甲素對照品粉末20 mg,置于100 mL量瓶中,用混合均勻的流動相溶液(三乙胺∶乙腈=6∶4)溶解并定容,即得草烏甲素對照品溶液。

2.1.2色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5 C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:質量濃度0.2 mg·mL-1三乙胺[用磷酸調節pH值至(3.1±0.1)]-乙腈(60∶40);進樣量:20 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長:260 nm;流速:1 mL·min-1。

2.1.3線性關系考察 精密吸取2.1.1項下制備的草烏甲素對照品溶液5、50、250、500、1 000、2 500、5 000、7 500 μL,分別置于10 mL量瓶中,用流動相定容后制成0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg·mL-1的系列質量濃度草烏甲素對照品溶液,按照2.1.2項下的色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標(y)、質量濃度為橫坐標(x)進行線性回歸,得到回歸方程:y=33.252x+8.954 9,R2=0.999 5,草烏甲素質量濃度在0.100～200.400 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.4精密度實驗 吸取2.1.3項下制備的20.0、50.0、100.0 μg·mL-1的草烏甲素對照品溶液,按照2.1.2項下的色譜條件連續進樣6次,記錄峰面積,并計算日內精密度RSD;連續3 d進樣檢測,計算日間精密度RSD。計算得20、50、100 μg·mL-1的草烏甲素對照品溶液日內精密度的RSD分別為0.178%、0.473%、0.063%(n=6);日間精密度的RSD分別為0.012%、0.28%、0.22%(n=6)。

2.1.5穩定性實驗 取2.1.1項下配制的草烏甲素對照品溶液,按照2.1.1項下的色譜條件,分別放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后,測定草烏甲素的峰面積,計算得平均RSD為1.03%,表明供試品溶液的穩定性良好。

2.1.6回收率實驗 精密量取2.1.3項下制備的20、50、100 μg·mL-1草烏甲素對照品溶液,置于100 mL量瓶中,分別置于100%處方對應的輔料量各3份,置于恒溫振蕩儀中振蕩48 h(37 ℃),超聲約1 h使其完全溶解,靜置冷卻至室溫,以8 000 r·min-1離心。取上清液1 mL,分別置于10 mL量瓶中,用混合的流動相定容,再用0.45 μm微孔濾膜過濾,搖勻,按照2.1.2項下的色譜條件進行測定,記錄峰面積,測定含量并計算回收率。計算得低、中、高質量濃度的平均回收率為100.01%,RSD為1.06%(n=3),符合相關規定。

2.2 草烏甲素在輔料中溶解度的測定

取過量的草烏甲素置于試管中,分別依次加入油相、乳化劑和助乳化劑2 g,超聲至不再溶解,放置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩48 h。取出靜置,以8 000 r·min-1離心。取上清液1 mL,分別置于10 mL量瓶中,用混合的流動相定容,再用0.45 μm微孔濾膜過濾,用HPLC法進行含量測定,測定草烏甲素在不同溶劑中的溶解度,見表1。由表1可知,草烏甲素在油相中的溶解度:油酸>MCT油>大豆油>肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)>油酸乙酯>棕櫚酸異丙酯(palmitic acid isopropyl ester);在乳化劑中的溶解度:RH40>labrasol>HEL-35>吐溫80;在助乳化劑中的溶解度:transcutol P>丙二醇。因此,選擇油酸作為油相,RH40作為乳化劑,transcutol P作為助乳化劑,用偽三元相圖進一步篩選。

表1 草烏甲素在不同溶劑中的溶解度

2.3 偽三元相圖的繪制

用加水滴定法建立草烏甲素納米乳的偽三元相圖,對于每個相圖,先將乳化劑和助乳化劑按照不同的比例(Km,1∶1、2∶1、3∶1、4∶1)進行混合得到混合乳化劑,再將混合乳化劑和油相以1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例進行混合,在55 ℃用磁力攪拌器攪拌,轉速為1 000 r·min-1,逐漸向混合體系中滴加純化水,當混合體系達到濁點,即體系由澄清變為渾濁,繼續攪拌溶液又可以恢復澄清狀態時,依次記錄各組分的質量分數,用Origin Pro 2019軟件繪制偽三元相圖,比較所形成的微乳區面積的大小以確定Km值,見圖1。由圖1可見,當乳化劑RH40和助乳化劑transcutol P的比例為1∶1時,繪制的偽三元相圖形成的微乳區面積最大,故確定1∶1為乳化劑和助乳化劑的最佳質量比,由于用加水滴定法制備的納米乳只是粗乳,故還需要用微射流均質機進行均質。

注:A.Km=1∶1;B.Km=2∶1;C.Km=3∶1;D.Km=4∶1。

2.4 微射流均質制備納米乳

通過預實驗初步得到納米乳的制備方法,按照處方量,先將草烏甲素溶于油相,再與乳化劑混合后用磁力攪拌器攪拌,一邊不斷滴加純化水,攪拌1 h,攪拌溫度為55 ℃,攪拌速度為1 000 r·min-1。置于高剪切乳化機中以一定速度剪切45次,形成初乳。將剪切好的初乳用微射流均質機以20 000 psi的壓力均質6次,即得納米乳。

2.5 Box-Behnken響應面法優化草烏甲素納米乳的制備工藝

2.5.1Box-Behnken響應面法的實驗方案 用Design-Expert 10.0軟件對草烏甲素納米乳的制備工藝進行優化,經過單因素實驗篩選,以油相的比例(A)、混合乳化劑的比例(B)、均質壓力(C)為自變量,草烏甲素納米乳的粒徑為響應值,用3因素3水平響應面法進行實驗,建立回歸模型,確定草烏甲素納米乳的最佳制備工藝,實驗設計因素水平見表2,具體實驗設計方案與結果見表3。

表2 響應面法的實驗設計

表3 響應面法實驗設計結果

2.5.2模型擬合和統計分析 根據實驗數據計算多項式方程的系數以預測響應變量的值。回歸方程為粒徑=104.454+16.785A-16.307 5B-10.005C-9.002 5AB-0.137 5AC-1.227 5BC-3.073 25A2+3.361 75B2+3.771 75C2。統計分析結果見表4。建立的回歸模型F=171.63,P<0.000 1,表明此方程的回歸模型擬合良好,具有統計學意義,R2=0.995 5,變異系數(coefficient of variation)=1.80%,表明該模型擬合度良好,實驗方法可靠,實驗誤差較小;F失擬值=0.240 1,P=0.864 6>0.05,表明該模型失擬值不顯著,實驗中的未知因素對實驗的干擾較小,該模型可用于預測和分析實際的數據。

表4 回歸模型方差分析結果

2.5.3響應面法分析交互作用 用Design-Expert 10.0軟件繪制二維等高線圖及三維響應面圖,在其中1個因素不變的條件下,分析另外2個因素之間的交互作用對草烏甲素納米乳粒徑的影響,以確定草烏甲素納米乳的最佳制備工藝,結果見圖2。曲面和等高線的形狀不同,交互效應的強弱也不同。交互項的等高線圖越接近橢圓形,且曲面圖越陡峭,表明交互作用越強。由圖2可見,油相的比例(A)與乳化劑的比例(B)之間的交互作用顯著,且油相對草烏甲素納米乳的制備工藝影響較大,形成的三維響應面圖較陡峭。

注:A.油相和乳化劑比例的響應面圖;B.均質壓力和乳化劑比例的響應面圖;C.油相比例和均質壓力的響應面圖;D.油相比例和乳化劑比例的等高線圖;E.乳化劑比例和均質壓力的等高線圖;F.油相比例和均質壓力的等高線圖。

2.5.4最優處方及驗證實驗 根據模型擬合結果,草烏甲素納米乳的最佳制備工藝為油相的比例為8%、乳化劑的比例為11%、均質壓力為28 000 psi,得到的最佳粒徑為60.25 nm。

按照最優處方制備3批草烏甲素納米乳,進行驗證實驗,測得納米乳粒徑與預測值(60.25 nm)的偏差分別為1.72%、0.87%、1.12%,表明所建立的數學模型可以準確預測草烏甲素納米乳的最優處方。

2.6 納米乳的粒徑和形態

吸取0.1 mL草烏甲素納米乳,用純化水稀釋100倍,用BIC 90 Plus型激光粒度儀測量納米乳液的平均粒徑、多分散系數和Zeta電位。結果表明,草烏甲素納米乳的粒徑為(60.55±0.88) nm,多分散系數為(0.233±0.22),Zeta電位為(-28.5±0.34) mV。草烏甲素納米乳的粒徑分布及Zeta電位見圖3。

取適量的草烏甲素納米乳,用去離子水稀釋,滴在覆蓋有碳膜的銅網上,滴加質量分數為1%的磷鎢酸染色2 min,用濾紙吸取多余的溶液,自然晾干后再置于透射電子顯微鏡下觀察納米乳液的形態[11],見圖4。由圖4可見,形成的納米乳液滴外觀圓整,大小均一。

圖4 透射電鏡圖

2.7 草烏甲素納米乳的穩定性實驗

將草烏甲素納米乳液分別置于4、25、60 ℃下保存,并于5、10、15、30、60 d分別測定粒徑,分析其穩定性。結果見圖5。

圖5 不同儲存時間和溫度下粒徑的變化

由圖5可見,儲存溫度和儲存時間對草烏甲素納米乳的粒徑有影響,隨著時間的延長,粒徑增大,這是因為隨著時間的延長,出現了奧斯特熟化現象,表現為納米乳液開始出現聚集現象,納米乳的粒徑逐漸增大,使得乳液的穩定性降低,并且溫度越高,奧斯特熟化現象越嚴重,納米乳的粒徑越大,穩定性下降得越快。因此,在低溫條件下儲存才能防止奧斯特熟化現象的發生,制備的納米乳在4 ℃下儲存60 d穩定性良好,表明草烏甲素納米乳應置于低溫條件下儲存。

2.8 草烏甲素納米乳的體外透皮實驗

先將Strat-M膜裝在供給池與接收池之間,再將適量草烏甲素納米乳加入Strat-M膜內,在接收池中加入接收液至刻度線,注意用超聲排除氣泡。接收液為9 g·L-1氯化鈉溶液(溶劑為體積分數60%乙醇),磁力攪拌速度為400 r·min-1,水浴加熱溫度為(32±0.1) ℃。分別于2、4、6、8、12、24 h取樣,每次取樣7 mL,同時補加7 mL接收液。樣品溶液用0.45 μm濾膜過濾,用高效液相色譜法測定其中草烏甲素的含量,并計算累積透皮量(Qn)。

其中Qn為累積透皮量,Cn為第n個時間點樣品的質量濃度,V為接收池體積,Ci為第i個時間點樣品的質量濃度,Vo為每次取樣的體積。

以Qn對時間(t)作圖,見圖6,并對曲線中的直線部分進行線性回歸,將數據分別用零級方程、一級方程、Higuchi方程擬合,見表5。由表5可見,草烏甲素納米乳在24 h內的釋放數據均符合一級方程,表明所制備的草烏甲素納米乳具有緩釋效果。納米乳中草烏甲素24 h的累積透皮量為(260.851 2±7.763 9) μg·cm-2。

圖6 草烏甲素納米乳體外透皮單位面積內的累積透過量

表5 草烏甲素納米乳的3種模型擬合結果

3 討論

納米乳液可以用高能法和低能法2種方法制備,高能法包括高壓均質法、微流態化和超聲波法,低能法包括反相乳化法和自納米乳化法。低能乳化法需要耗費大量的油相和乳化劑,而高能乳化法如用微射流均質器在低濃度的油相和乳化劑下就能產生穩定的納米乳劑,并且粒徑更小、更穩定。與均質器相比,微流化器產生的納米乳劑的粒度分布更窄[14]。另外,微流化器在低濃度的表面活性劑下可產生穩定的納米乳劑。因此,本研究用微射流均質制備納米乳,得到粒徑更小、更穩定的納米乳。

根據斯托克斯定律,液滴的直徑越小,重力分離速度越慢,乳狀液的穩定性越好[15],所以以乳狀液的平均直徑為指標來確定合適的均質壓力、油相比例和乳化劑比例。用單因素實驗結合Box-Behnken響應面法優化草烏甲素納米乳的制備工藝時發現,隨著油相比例的增加,納米乳的粒徑先減小后增大,原因可能是油相的比例越大,意味著要覆蓋的油/水界面越大,體系中乳化劑的量不足以覆蓋新形成的液滴,這可能會導致液滴直徑的增大。納米乳的平均粒徑隨著乳化劑加入量的減少而逐漸減小,原因可能是當助乳化劑加入量增大時,水相的比例較大,導致乳滴不穩定,存在合并現象[16]。均質壓力和循環次數的增加往往會伴隨著納米乳液溫度的上升。研究表明,高壓均質過程中樣品溫度的升高通過影響納米乳液的性質(液滴直徑、黏度和界面張力)而影響納米乳液的穩定性[17]。所以在制備納米乳時不能一味地增加均質壓力和均質次數。此外,在加工過程中,高的均質壓力、均質次數和溫度可能會導致草烏甲素降解成烏頭堿和次烏頭堿。因此,為了最大限度地減少納米乳中草烏甲素的損失,選擇不超過30 000 psi的均質壓力和不超過10次的均質循環進行研究。

研究結果顯示,角質層屏障是藥物透皮的主要障礙[18],與其他載體相比,納米乳具有更好的透皮作用[19],這是因為納米乳具有較低的表面張力,易于濕潤皮膚,可使角質層結構發生變化,增加脂質雙分子層的流動性,破壞水性通道以及降低其屏障作用[20],并且納米乳的直徑很小,有良好的流動性,且能與皮膚細胞產生水合作用,可有效促進小分子藥物的透皮吸收、緩釋、降低藥物刺激[21]。草烏甲素納米乳體外滲透性好還與transcutol P有關,transcutol P可以很容易地穿透角質層,并與細胞間路徑發生水合作用,以改善活性藥物成分的皮膚滲透性[22],而且還能改變角質層蛋白質和脂肪分子的流動性,即降低皮膚屏障功能,利于藥物的透皮吸收[23]。