地黃不同炮制品的抗氧化及酶促褐變反應活性比較研究

王 珊,許海燕,侯敏娜,彭修娟,王 青,劉艷紅,劉 峰

1.陜西國際商貿學院,咸陽 712046; 2.陜西步長制藥有限公司,西安 710075

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch. 的新鮮或干燥塊根[1],始載于《神農本草經》[2],并被列為上品。地黃在全國各地均有栽培,主產于河南、山東、山西等省,以河南溫縣、孟縣、武陟等地栽培歷史最長,產量最高,于秋季采挖,除去蘆頭、須根及泥沙,鮮用,習稱“鮮地黃”;或將地黃緩緩烘焙至約八成干,習稱“生地黃”。鮮地黃性寒,味甘、苦,偏于清熱生津、涼血止血;生地黃性甘、寒,長于清熱涼血、養陰、生津。地黃經酒燉或清蒸法制成的熟地黃,其味甘,性微溫,具有滋陰補血、益精填髓之功效[3]。通過對《神農本草經》《本草經集注》[4]《備急千金要方》[5]等相關古籍文獻進行查閱和總結,發現鮮地黃與生地黃和熟地黃的功效不一致,且“生者尤良”,其中鮮地黃可外用,可內服,還可用于養生保健。

地黃臨床上主要用于治療腎陰虛引起的各種病證。腎臟疾病的病理類型多樣,診治較為復雜。而現代研究結果顯示,多種慢性腎臟疾病的發生、發展均有氧化應激反應的參與[6],其在多種腎臟疾病的發生、發展中發揮重要作用。氧化應激是指機體面對各種有害刺激時所產生的反應,機體的氧化系統和抗氧化系統失去平衡,產生大量氧化應激產物,在體內大量蓄積,這些產物被稱為活性氧(reactive oxygen species, ROS),包括超氧陰離子、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基等[7],因此推測地黃具有抗氧化應激的作用。目前對生地黃和熟地黃的抗氧化活性已有研究報道[8-10],但關于鮮地黃、生地黃、熟地黃的抗氧化活性差異性比較的研究較少。

地黃不同炮制品的臨床功效的差異性與其外觀性狀等有一定的相關性。鮮地黃、生地黃和熟地黃的外觀差異較大,尤其是顏色,其主要原因是藥材在采收、加工、儲藏等過程中發生了酶促褐變反應。有關酶促褐變反應發生的確切途徑還在研究,但目前普遍認為涉及2個途徑,第一是酚類化合物被氧化為醌類化合物,第二是酚類化合物在發生氧化反應的同時還會發生自身聚合。褐變的顏色取決于化合物本身的光譜特征、酶底物的來源和pH值[11]。通過對酶促褐變反應機制的分析可知,酶促褐變反應的產生主要是化合物發生了氧化反應。

因此本文將用3種體外抗氧化活性模型對鮮地黃、生地黃及熟地黃的抗氧化活性進行初步的研究,為揭示地黃具有滋補腎陰且能抗氧化應激提供一定的理論依據。同時通過對鮮地黃、生地黃及熟地黃的褐變酶活性進行檢測分析,為揭示地黃不同炮制品之間氧化活性的差異提供一定的理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外分光光度計(T6-新世紀,北京普析通用股份有限公司);XP-205電子天平(梅特勒-托利多國際貿易有限公司);DZF-6090真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);LGJ-12D型冷凍干燥機(北京四環啟航科技有限公司);OM-1500A小型噴霧干燥機(上海歐蒙實業有限公司);DHG-9075鼓風干燥箱(上海勘藍儀器科技有限公司);DC-3010電子恒溫電浴爐(上?，槴\實驗設備有限公司);HR1832飛利浦榨汁機[飛利浦電子技術(上海)有限公司];WBZ-10微波真空干燥機(貴陽新奇微波工業有限責任公司)。

1.2 試藥

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH,Alfa Aesar公司);2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azobis-3-ethylbenzoinesulfonic acid,ABTS)、三吡啶三吖嗪[2,4,6-tri (2-pyridyl)-1,3,5-triazine,TPTZ]均購自日本東京化成工業株式會社;6水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、7水合硫酸鐵(FeSO4·7H2O)、過硫酸鉀(K2S2O8)、醋酸鈉(CH3COONa)均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇、甲醇均為分析純,購自天津恒興化學試劑有限公司;鄰苯二酚(Sigma公司);愈創木酚、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均購自天津市光復精細化工研究所;十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、體積分數為30%的過氧化氫均為分析純,購自北京化工廠;高純水(美國Millipore公司)。

鮮地黃、生地黃及熟地黃樣品均于2021年從道地產區直接收集,經陜西國際商貿學院雷國蓮教授鑒定為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根。

2 方法與結果

2.1 鮮地黃、生地黃及熟地黃的不同提取物抗氧化活性的比較

2.1.1鮮地黃樣品的制備 取適量鮮地黃清洗干凈,晾干,用榨汁機榨汁,取地黃汁用微波真空干燥機進行干燥(置于微波真空干燥機內進行干燥,設定真空度為-0.05 MPa,初始溫度為25.5 ℃,干燥至含水率低于10%),得鮮地黃粉末,備用。

2.1.2工作液的配制 準確稱取DPPH適量,用無水乙醇溶解配制成200 μmol·L-1的儲備液,即得。

將7 mmol·L-1的ABTS與2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液等體積混勻,室溫避光放置16 h,即得ABTS儲備液。使用前用甲醇或無水乙醇稀釋至吸光度為0.7±0.002,得ABTS工作液。

TPTZ工作液:由0.3 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1FeCl3·6H2O溶液組成,三者體積比為10∶1∶1,TPTZ工作液需要新鮮制備,使用前將3種儲備液按上述體積比混合。

不同濃度硫酸亞鐵溶液:精密稱取FeSO4·7H2O 0.020 86 g置于25 mL量瓶中,以純凈水溶解并定容,配制成3 mmol·L-1FeSO4溶液,分別取3 mmol·L-1FeSO4溶液5、4、3、2、1、0.5、0.1 mL,置于7個10 mL量瓶中,用純凈水定容,配制成1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15、0.03 mmol·L-1的FeSO4溶液。

2.1.3供試品溶液的配制 分別稱取10批生地黃和熟地黃樣品適量,干燥,粉粹,過80目篩,再分別稱取鮮地黃、生地黃和熟地黃粉末各0.15 g(平行3份),精密稱定,加入30 mL純凈水,超聲處理30 min,濾過,將濾液用水稀釋至一系列質量濃度,備用。

2.1.4樣品的測定 (1)DPPH·(DPPH自由基)清除實驗 參考文獻[12-13],取2 mL 200 μmol·L-1DPPH溶液與2 mL供試品溶液室溫反應30 min,并于517 nm處測定混合液的吸光度(A)值,重復3次取平均值。根據公式:清除率(%) = [1-(Ai-Aj)/A0]×100%(式中:Ai為2 mL 200 μmol·L-1DPPH乙醇溶液+2 mL供試品溶液的吸光度;Aj為2 mL 無水乙醇溶液+2 mL供試品溶液的吸光度;A0為2 mL 200 μmol·L-1DPPH乙醇溶液+2 mL空白試劑的吸光度)計算DPPH·清除率,其中供試品的清除自由基能力用清除DPPH·的半數抑制率(IC50)值表示。

DPPH法分為動力學法和靜力學法。本文用DPPH靜力學法,其檢測的是樣品清除DPPH·的量或DPPH·與某一供氫體反應的化學計量關系或復雜混合物中活性-OH·的量,常以IC50表示[14]。該方法具有操作簡單、快速、靈敏、易重復等優點。本實驗對鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物、醇提取物進行了DPPH實驗,結果見表1。由表1可知,地黃的不同炮制品均有一定的抗氧化活性,其中醇提取物的抗氧化活性高于水提取物;在水提取物清除DPPH·活性的實驗中,其清除DPPH·活性的排序為鮮地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物清除DPPH·活性實驗中,其清除DPPH·活性的排序為鮮地黃>生地黃>熟地黃。

表1 10批鮮地黃、生地黃和熟地黃不同提取物清除DPPH·的實驗結果

通過對數據進行顯著性分析發現,鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物和醇提取物的抗氧化活性有顯著性差異,其中醇提取物的抗氧化活性顯著高于水提取物(P<0.01);在水提取物實驗中,與鮮地黃比較,生地黃和熟地黃水提取物的抗氧化活性均顯著低于鮮地黃(P<0.01);在醇提取物實驗中,與鮮地黃比較,生地黃和熟地黃醇提取物的抗氧化活性均顯著低于鮮地黃(P<0.01)。

(2)ABTS·(ABTS自由基)清除實驗 參考文獻[12,14],取3 mL ABTS工作液與0.5 mL供試品溶液混勻,室溫反應60 min,并于734 nm處測定其A值,重復3次取平均值,計算ABTS·清除率(清除率計算公式同2.1.4項下公式),同時以清除ABTS·的IC50值表示供試品清除自由基的能力。

該實驗通過檢測單氧離子自由基ABTS·來表示抗氧化劑清除自由基的能力,該方法操作簡單,反應速度相對較快,適用的pH范圍較廣,無論親水性還是親脂性的抗氧化劑均可適用,而且拓寬了DPPH法的應用范圍,有研究表明抗氧化劑清除ABTS·的效率高于DPPH·[15]。本實驗對鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物、醇提取物進行了ABTS·清除實驗,結果見表2。由表2可知,地黃的不同炮制品均有一定清除ABTS·的能力,其中醇提取物的活性高于水提取物;在水提取物清除ABTS·活性的實驗中,其清除ABTS·活性的排序為鮮地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物清除ABTS·活性實驗中,其清除ABTS·活性的排序為鮮地黃>生地黃>熟地黃。

表2 10批鮮地黃、生地黃和熟地黃不同提取物清除ABTS·的實驗結果

通過對數據進行顯著性分析發現,鮮地黃和生地黃醇提取物的抗氧化活性顯著高于水提取物的抗氧化活性(P<0.01),熟地黃水提取物和醇提取物的抗氧化活性比較差異無統計學意義;在水提取物和醇提取物的抗氧化活性實驗中,生地黃的抗氧化活性顯著低于鮮地黃(P<0.01),熟地黃的抗氧化活性與鮮地黃比較差異無統計學意義。

(3)FRAP活性測定實驗 參考文獻[12,14],取0.5 mL各供試品溶液,加入FRAP工作液3 mL,混勻反應75 min,并于734 nm處測定A值,重復3次取平均值。

以FeSO4為標準物質繪制標準曲線,求回歸方程,樣品的抗氧化能力以FRAP值表示:1FRAP單位=1 mmol·L-1FeSO4,即樣品的抗氧化能力相當于FeSO4的mmol·L-1數。將不同濃度的 FeSO4溶液代替樣品溶液,同上操作測定A值,以A為縱坐標、質量濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程A=0.705 3C+0.119 2(R2=0.999 2)。將一系列供試品溶液所測的A值代入上述標準曲線,計算FeSO4當量值。FeSO4當量值越大,表示樣品的還原能力越強。

鐵離子還原能力法是基于氧化還原反應的比色法,其操作簡單、快速、重復性好、廉價且易于標準化,與其他方法聯合使用,能區別不同反應機制的方法測量結果的差異。FRAP法反映的不是樣品對某一種自由基的清除活性,而是樣品的總還原能力,目前該法測定結果可用來反映樣品的總抗氧化活性[15]。本實驗對鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物、醇提取物進行了FRAP實驗,結果見圖1。

圖1 鮮地黃、生地黃和熟地黃不同提取物的鐵離子還原能力考察

FRAP實驗中各樣品的鐵離子還原能力用圖1中相應曲線的斜率表示。由圖1可知,地黃不同炮制品的總還原能力與DPPH及ABTS實驗結果基本一致,其各炮制品的醇提取物的總還原能力強于水提取物;在水提取物的實驗中,其總還原能力依次為鮮地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物實驗中,其總還原能力強弱依次為鮮地黃>生地黃>熟地黃。

2.2 鮮地黃、生地黃和熟地黃褐變酶活性的比較

2.2.1溶液的配制 以下溶液的配制參考文獻[16]略有修改。

(1)0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)的配制。A母液:精密稱取Na2HPO4·12H2O 35.81 g,用蒸餾水定容至500 mL得到0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液,即得;B母液:精密稱取NaH2PO4·2H2O 15.60 g,用蒸餾水定容至500 mL得到0.2 mol·L-1的磷酸二氫鈉溶液,即得;pH 6.0的0.05 mol·L-1PBS:分別精密移取A母液12.5 mL和B母液112.5 mL,再加入10 g PVP和0.019 g EDTA-Na2,用蒸餾水定容至500 mL即得0.05 mol·L-1PBS (pH6.0,含體積分數為1%的PVP,0.1 mmol·L-1EDTA-Na2);pH 7.8的0.05 mol·L-1PBS:分別精密移取A母液112.5 mL和B母液12.5 mL,再加入10 g PVP和0.019 g EDTA-Na2,用蒸餾水定容至500 mL即得0.05 mol·L-1PBS(pH7.8,含體積分數為1%的 PVP,0.1 mmol·L-1EDTA-Na2)。

(2)0.05 mol·L-1鄰苯二酚的配制:精密稱取鄰苯二酚0.55 g,加蒸餾水定容至100 mL,即得。

(3)體積分數為2%的 H2O2的配制:精密移取6.7 mL體積分數為 30%的 H2O2,加蒸餾水定容至100 mL,即得。

(4)0.05 mol·L-1愈創木酚的配制:精密移取愈創木酚555 μL,加PBS(pH 7.8)定容至100 mL,即得,4 ℃避光保存。

2.2.2地黃粗酶液的制備

(1)多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的制備:從-80 ℃冰箱中取出鮮地黃、生地黃和熟地黃樣品,精密稱取0.5～2 g,置于研缽(已冰浴)中,加入2 mL 4 ℃下預冷的0.05 mol·L-1PBS(pH 6.0)研磨成勻漿,將勻漿轉移至15 mL離心管中,再用6 mL PBS分次沖洗研缽,然后于4 ℃以 10 000 r·min-1離心15 min,將上清液轉移至10 mL量瓶中,定容,于4 ℃ 以10 000 r·min-1離心15 min,得到的上清液即為PPO粗酶液。

(2)過氧化物酶(peroxidase,POD)的制備:操作同PPO酶的制備方法,不同之處在于用0.05 mol·L-1PBS(pH 7.8)代替0.05 mol·L-1PBS(pH 6.0)進行制備。

2.2.3酶活性的測定 PPO廣泛存在于自然界中,幾乎所有植物細胞中都或多或少地存在PPO[17],而且PPO在果、蔬及中藥材的褐變中發揮著不可替代的作用[11,18]。POD廣泛存在于各類生命體中,其特點是含有鐵和銅等離子的一類氧化還原酶,在H2O2存在下能催化酚類、黃酮類的氧化和聚合,導致組織褐變[19]。

有研究發現,POD的催化能力甚至強于PPO。因此本文對PPO和POD酶活性分別進行了測定。

(1)PPO酶活性測定步驟與計算公式:PPO酶活性測定中所需要試劑、反應試管分組及各試液的配比見表3。

表3 PPO酶活性測定的反應液

將表3中各試管立即放入37 ℃的水浴鍋中保溫10 min以上,向4號試管中加入0.5 mL PBS(pH 6.0),混勻,在410 nm處調零,再向測定管中加入0.5 mL粗酶液,混合均勻后立即計時并測定,每30 s讀取1次,共測2 min,做3組重復實驗。待測定管全部測定完后,計算酶活性。

計算方法:以ΔA410每分鐘內變化0.01為1個PPO酶活性單位,以此計算出PPO酶活性。

式中:ΔA為反應時間內410 nm處吸光度的變化;Wt為地黃樣品的鮮質量(g);t為反應時間(min);D為稀釋倍數,即提取的總酶液為反應系統內酶液的倍數。

本實驗對生地黃、鮮地黃和熟地黃中PPO酶的活性進行檢測,結果見表4,其結果與POD酶活性檢測結果基本一致。地黃不同炮制品的PPO酶活性從高到低依次為生地黃>鮮地黃>熟地黃。通過顯著性分析發現,與鮮地黃比較,生地黃PPO酶活性顯著高于鮮地黃(P<0.01),熟地黃PPO酶活性顯著低于鮮地黃(P<0.01);與生地黃相比較,熟地黃的PPO酶活性顯著低于生地黃(P<0.01)。

表4 鮮地黃、生地黃和熟地黃中PPO酶活性的檢測結果

(2)POD酶活性測定步驟與計算公式:POD酶活性測定中所需要試劑、反應試管分組及各試液的配比見表5。

表5 POD酶活性測定的反應液

將表5中的各試管立即放入37 ℃的水浴鍋中保溫5 min以上,向4號試管中加入1 mL粗酶液,混勻,在470 nm處調零,再向測定管中加入1 mL粗酶液,混勻后立即計時并測定,每30 s讀取1次,共測2 min,重復測定3次,待測定管全部測定完畢后,計算酶活性。

計算方法:以每分鐘內A470變化0.01為1個POD酶活性單位,以此計算出POD酶活性。

式中:ΔA470為反應時間內吸光度的變化;Vt為提取酶液的總體積(mL);W為地黃樣品的質量(g);Vs為測定時取用酶液體積(mL);t為反應時間(min)。

本實驗對鮮地黃、生地黃和熟地黃中POD酶的活性進行檢測,結果見表6。地黃不同炮制品的POD酶活性從高到低依次為生地黃>鮮地黃>熟地黃。通過顯著性分析發現,與鮮地黃比較,生地黃POD酶活性均顯著高于鮮地黃(P<0.01),熟地黃POD酶活性顯著低于鮮地黃(P<0.01);與生地黃比較,熟地黃的POD酶活性顯著低于生地黃(P<0.01)。

表6 鮮地黃、生地黃和熟地黃中POD酶活性的檢測結果

3 討論

地黃具有悠久的臨床應用歷史,且地黃的不同炮制品各具有獨特的臨床功效。本文通過對古籍文獻進行查閱,發現鮮地黃、生地黃及熟地黃的功效不一致。地黃的不同炮制品均歸于腎經,主要應用于腎陰虛證。鮮地黃性寒,偏于清熱生津、涼血止血,生地黃性甘、寒,長于清熱涼血、養陰、生津。而熟地黃具有滋陰補血、益精填髓之功效,三者的功效有較為明顯的差異,直接用干地黃替換鮮地黃并不能發揮鮮地黃的特殊療效。但由于鮮藥汁多鮮嫩,容易腐爛變質,且受季節限制,每年因為鮮藥材未及時加工、儲存不當等,造成鮮藥的腐爛率超過30%,所以鮮藥逐漸被易保存的干燥藥材替代,也形成了以干燥藥材為主的中醫藥學臨床應用的理論體系。但是部分藥材鮮品獨特的功效是干品藥材所無法替代的。因此本實驗以地黃為示范,對鮮地黃進行榨汁,對其汁進行微波干燥,以此來代替鮮地黃,而現代藥理學研究發現腎臟疾病的產生與氧化應激有著密切的關系[6],故用體外抗氧化模型將其與生地黃和熟地黃的抗氧化活性進行比較評價,希望以此為突破口揭示鮮地黃、生地黃及熟地黃的臨床療效的差異及作用機制。同時通過檢測鮮地黃、生地黃及熟地黃的褐變酶活性來揭示地黃不同炮制品之間抗氧化活性差異性的原因。

實驗結果發現,地黃的不同炮制品均有一定的抗氧化活性,其中鮮地黃的抗氧化活性最好;在水提取物實驗中,地黃不同炮制品在3種體外抗氧化活性實驗中,其抗氧化活性能力依次為鮮地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物實驗中,地黃不同炮制品在3種體外抗氧化活性實驗中,其抗氧化活性能力依次為鮮地黃>生地黃>熟地黃。

本實驗通過對POD和PPO 2種褐變酶的活性檢測分析發現,地黃不同炮制品的褐變酶的活性差異較大;其中POD和PPO 2種褐變酶的活性實驗結果基本一致,生地黃的褐變酶活性最高,這也是生地黃顏色較深的原因之一;鮮地黃的褐變酶活性較低,這也是鮮地黃顏色為鮮黃色的原因之一;熟地黃為黑色,而褐變酶活性最低,這可能與熟地黃炮制過程需要反復蒸有關。研究發現,酶促褐變反應的產物仍具有一定的抗氧化性[11],但其褐變酶反應的強弱不同其抗氧化活性存在差異,且部分不能發生酶促褐變反應的底物本身也具有一定的抗氧化活性。本次實驗結果顯示,鮮地黃的褐變酶活性較低,其抗氧化活性最高;生地黃的褐變酶活性最高,其水提取物、醇提取物的抗氧化相對較低。熟地黃的褐變酶活性最低,其水提取物的抗氧化活性高于生地黃,這應該與熟地黃在加工后其多糖含量較高有關。通過對抗氧化活性與褐變酶活性的綜合比較分析可知,地黃的不同炮制品抗氧化活性與酶促褐變反應有一定的相關性。

目前有關藥物的抗氧化能力評價在臨床及食品業等領域均非常重要,體外抗氧化檢測方法由于其具有操作簡單、迅速、靈敏、成本低廉等優點,使其在食品、藥品等抗氧化效應的評價方面使用非常廣泛。但其最大的缺陷是無法真實模擬生理環境,不能確切地反映藥物的抗氧化性的實際作用效果,也存在有些體系或模型甚至與生理/病理無關,且僅測定了藥物抗氧化能力的某一方面,無法模擬生理條件下的多條抗氧化途徑。因此本課題組后期還需對地黃不同炮制品的體內抗氧化活性進行檢測及評價,進而更加有效地揭示地黃不同炮制品的臨床作用機制的差異性。