轉基因玉米MON87419實時熒光PCR定性檢測方法的建立

李凌燕, 肖 冰, 王顥潛, 烏 蘭, 鄧志峰, 陳 紅, 梁晉剛

(1.農業(yè)農村部科技發(fā)展中心, 北京 100176; 2.北京農業(yè)職業(yè)學院, 北京 102442;3.中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所, 北京 100081)

國際農業(yè)生物技術應用服務組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)年度報告顯示,2019年全球種植的轉基因玉米已達到6 090萬hm2,約占全球玉米種植總面積的31%[1]。轉基因耐除草劑玉米MON87419是孟山都遠東有限公司研發(fā)的玉米轉化體新品系,其中插入dom和pat基因,表現出對兩種除草劑麥草畏和草銨膦良好的抗性。目前,該轉化體已獲得我國進口用作加工原料的農業(yè)轉基因生物安全證書,建立針對該轉化體準確可靠的檢測方法,對我國轉基因生物安全監(jiān)管十分重要[2]。PCR(Polymerase Chain Reaction)檢測技術即聚合酶鏈式反應技術,是目前檢測轉基因生物最普遍的方法,包括普通PCR[3]、實時熒光PCR[4]、數字PCR[5]等。定性檢測主要以普通PCR和實時熒光PCR為主。兩種方法各有優(yōu)缺點,普通PCR技術設備普及、操作簡便、成本低,被廣泛地應用于轉基因成分檢測中,尤其被各國家用于轉基因成分的市場篩查[6-7];實時熒光PCR相較于普通PCR對環(huán)境的污染更小,加入了熒光基團靈敏度更高,普遍應用于轉基因作物的檢測,如轉基因的玉米[8]、大豆[9]、水稻[10]等。本研究采用實時熒光PCR方法對轉基因耐除草劑玉米MON87419進行檢測,建立了針對MON87419轉化體的定性PCR檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材 料

轉基因玉米MON87419、非轉基因受體玉米LH244,由孟山都遠東有限公司提供。特異性測試樣品中,其他轉基因玉米、大豆、水稻、油菜和棉花混合樣品以及大豆、玉米、棉花、水稻和油菜等非轉基因樣品均由本實驗室長期保存。轉基因作物混合樣品分別由多種轉化體按1%的質量分數百分比混合而成(表1)。

表1 轉基因作物混合樣品

1.2 主要試劑

TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒;TaqMan?Gene Expression Master Mix;引物和探針由上海生工生物公司合成;其余試劑均為國產分析純。

1.3 儀器設備

臺式冷凍離心機(Eppendorf),Q5000超微量紫外分光光度計(Quawell),C1000 型實時熒光PCR儀(Bio-rad)。

1.4 方 法

1.4.1基因組DNA的提取

將轉基因耐除草劑玉米MON87419及其受體種子育苗,按照植物基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取玉米植株基因組DNA,特異性測試相關樣品,提取種子基因組DNA。超微量紫外分光光度計測定DNA質量和濃度,用超純水將DNA溶液稀釋至50 ng/μL。

1.4.2引物和探針設計

分析了轉基因耐除草劑玉米MON87419分子特征,根據3′端側翼序列信息,綜合考慮核苷酸序列GC含量和引物Tm值,應用Beacon designer8設計實時熒光PCR定性檢測引物和探針。根據農業(yè)部2259號公告《轉基因植物及其產品成分檢測定性PCR方法制定指南》要求,實時熒光PCR產物長度宜為80～200 bp,正交組合12對實時熒光PCR特異性引物/探針組合,同時也將文獻中已報道的引物/探針組合3′-13引入實驗(表2)。以MON87419基因組DNA為模板對引物/探針組合進行篩選,并設置陰性對照(非轉基因受體玉米LH244)和空白對照。

表2 候選引物組合

1.4.3實時熒光PCR反應體系

反應體系:2×TaqMan?Gene Expression Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L的上下游引物各2.0 μL,10 μmol/L的探針1.0 μL,DNA模板50 ng,用ddH2O補充至25.0 μL;實時熒光PCR擴增程序:95 ℃、5 min,95 ℃、15 s,60 ℃、60 s,進行40次循環(huán);在第二階段的退火延伸(60 ℃)時段收集熒光信號。

2 結果與分析

2.1 引物和探針的設計與篩選

以1.4.1提取的MON87419基因組DNA為模板,對表2中前12對引物/探針組合進行篩選,結果顯示,12對引物探針組合均獲得特異性擴增,且組合3′-3、3′-6、3′-9和3′-12擴增Ct值較小,擴增效果較好(圖1A),對比引物和探針序列發(fā)現,3′-3與3′-9,3′-6與3′-12正反向引物一致,只有探針序列不一致,3′-9和3′-12探針位置更靠近上游,選擇3′-9、3′-12與已報道的引物探針組合3′-13進行比較,繼續(xù)進行下一步驗證。結果表明,在空白和陰性樣品中沒有擴增曲線,且3′-13組合Ct值較小,明顯優(yōu)于本實驗設計的引物/探針組合(圖1B)。因此,最終選用3′-13組合進行下一步的特異性測試,并將此引物/探針組合命名為MON87419-QF/QR/QP。

圖1 引物/探針篩選結果

2.2 特異性測試

利用1.4.1中特異性測試樣品的基因組DNA為模板,對檢測方法的特異性進行測試。結果表明,引物組合MON87419-QF/QR/QP具有良好的特異性,僅在轉基因玉米MON87419中獲得預期的擴增(圖2),可作為本方法的引物/探針進行后續(xù)測試。

注:1為空白對照;2為陰性對照;3為非轉基因棉花;4為轉基因大豆混合樣;5為其他轉基因玉米混合樣;6為轉基因棉花混合樣;7為轉基因水稻混合樣;8為轉基因油菜混合樣;9為非轉基因大豆;10為其他非轉基因玉米;11為MON87419;12為非轉基因水稻;13為非轉基因油菜。

2.3 反應條件優(yōu)化

以1.4.1中提取的MON87419基因組DNA為初始濃度,配制10%的MON87419 DNA為模板,設置0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 μmol/L共5個探針濃度,對應的引物濃度為探針濃度的2倍。通過特異性擴增曲線和Ct值篩選最優(yōu)組合。結果(圖3)表明,隨著探針濃度的增加,熒光擴增曲線上升幅度增大,Ct值略有減少,探針濃度為0.4 μmol/L及以上濃度時,Ct值基本保持不變。綜合考量擴增效率、體系配置及平臺期信號強度等因素,確定探針濃度為0.4 μmol/L,引物濃度為0.8 μmol/L。

注:0.1,0.2,0.3,0.4,0.5分別代表探針濃度(μmol/L)。

2.4 靈敏度測試

以1.4.1中提取的MON87419 基因組DNA為初始濃度,分別配制質量分數為50%,10%,1%,0.5%,0.05%和0.01%的樣品,進行靈敏度測試。測試結果(圖4)顯示,質量分數≥0.05%的樣品中均能獲得預期擴增曲線,重復性良好,說明該檢測方法的靈敏度可穩(wěn)定達到0.05%。

注:1～6分別為50%,10%,1%,0.5%,0.05%,0.019% MON87419。

2.5 檢出限測試

根據靈敏度測試結果,隨機取60份質量分數為0.05%的樣品進行檢出限測試。測試結果(圖5)表明,60次反應均有典型擴增曲線,可確定實時熒光PCR方法的檢出限可穩(wěn)定達到0.05%。

注:1為空白和陰性對照;2為MON87419。

3 結論與討論

轉基因玉米MON87419是孟山都遠東有限公司研發(fā)的轉dom和pat基因,耐受麥草畏和草銨膦兩種除草劑的玉米新品系,該轉化體已獲得進口用作加工原料的農業(yè)轉基因生物安全證書,亟需建立針對該轉化體的特異性檢測方法。Long Likun等[11]建立了針對該轉化體的特異性定量檢測方法,并進行了報道。本研究在該轉化體特異性序列3′端設計特異性引物和探針,同時將已報道的引物和探針引入該實驗進行對比研究,建立了該轉化體的實時熒光PCR定性檢測方法,為該玉米新品系的安全監(jiān)管提供科學依據和技術支撐。

PCR檢測方法是目前檢測轉化體最普遍的方法,也是近年來國內外轉基因產品檢測方法的首選[12-16],品系特異性PCR檢測根據核酸的檢測方法又可分為普通PCR、實時熒光PCR、數字PCR、多重復合PCR[17]、重組聚合酶擴增(RPA)[18]、環(huán)介導等溫擴增技術PCR方法[19]等,其中普通PCR、實時熒光PCR應用最為廣泛[20-21]。兩種PCR方法各有優(yōu)勢,普通PCR成本低、設備普及率高,但由于操作步驟中需要開蓋進行凝膠電泳檢測,容易產生氣溶膠從而污染實驗室環(huán)境和操作人員;實時熒光PCR成本略高,儀器相對昂貴,但操作中無需開蓋即可進行檢測,減少了污染,同時該方法加入熒光基團,提高了檢測靈敏度。我國目前的轉基因產品檢測標準體系以定性PCR方法為主,而國際檢測標準體系中以實時熒光PCR方法為主[22],實時熒光PCR是轉基因檢測的必然趨勢。本研究建立了實時熒光PCR定性檢測方法,該方法特異性強、靈敏度高,可為該玉米品系的特異性檢測提供技術支撐,為我國轉基因生物安全管理部門實施各項安全管理制度提供科學方法。

本方法以轉基因耐除草劑玉米MON87419 3′端特異性序列為靶標,分析序列信息后設計引物,經體系優(yōu)化、特異性測試、靈敏度測試及檢出限測試,建立了轉基因玉米MON87419的實時熒光PCR定性檢測方法。結果表明,該方法可檢測出轉基因耐除草劑玉米MON87419轉化體成分,具有穩(wěn)定性好、特異性強、靈敏度高的特點。實時熒光PCR檢測方法的引物濃度設置為0.8 μmol/L、探針濃度設置為0.4 μmol/L,檢出限可穩(wěn)定達到0.05%。