高溫脅迫條件下玉米Hsf家族成員的基因結構與表達研究

陳 偉, 劉小紅, 龍 蕓, 張詠祀, 李仕偉, 劉婭娟, 侯凌鵬, 楊海鵬, 張 杰

(1.山西農業大學玉米研究所, 山西 忻州 034000; 2.西華師范大學生命科學學院, 四川 南充 637000;3.廳市共建甘薯及特色豆科作物種質創新與利用四川省重點實驗室, 四川 南充 637000)

玉米(ZeamaysL.)是世界三大作物之一,在糧食、飼料及工業原料等方面都有著廣泛用途[1]。隨著全球氣溫的逐年升高,局部高溫、干旱等極端天氣頻發,該氣候變化已對玉米產量和品質產生了嚴重危害[2]。在我國很多地區,夏玉米常受到高溫脅迫的影響[3-4],如2022年7—8月在中國南方很多區域持續的高溫天氣(部分地區40 ℃以上高溫持續多日),對山區玉米生產造成了嚴重影響,導致其大幅減產甚至絕收。據專家預測,未來高溫可能成為常態,因此,培育耐高溫脅迫的玉米品種在玉米生產中顯得尤其重要。

選育耐高溫脅迫的玉米材料,首先要了解玉米耐高溫脅迫的分子遺傳機制。在玉米整個生育期,最易遭受高溫危害的是開花散粉期和灌漿期[5]。7—8月是一年中最熱的時期,也正是玉米開花散粉和灌漿期,這一時期遇上高溫,可導致花粉活力下降或敗育、花絲萎蔫、籽粒不夠飽滿,進而引起玉米減產、品質降低。高溫脅迫下,植株體內會產生應激反應現象,有眾多的基因表達會受到抑制或激發,即表現為上調或下調表達,其中熱休克轉錄因子(Heat shock transcription factor,Hsf) 家族成員響應特別明顯。Hsf在動植物及微生物中廣泛存在,在調控逆境脅迫方面起著非常重要的作用[6],如高溫[7]、干旱[8]等。單個的玉米Hsf基因有一些研究[9-10],但一次對多個Hsf成員分析以認識玉米耐高溫脅迫分子機制的研究鮮有報道。所以,以玉米花粉為材料,以Hsf家族基因成員為對象,通過基因克隆、表達及功能鑒定等對認識花粉耐高溫脅迫的分子遺傳機制、挖掘利用耐高溫脅迫的基因有著非常重要的意義。

基因克隆及表達研究有多種方法,對于有參考基因組序列信息的植物材料來說,要對眾多的基因開展克隆及表達研究,轉錄組測序是一種經濟有效的試驗手段[11-13]。目前,轉錄組測序主要有二代測序和三代測序,二代測序相對來說讀長較短,只有通過拼接才能得知全長轉錄本信息,但是測序成本相對較低[14-15];三代測序讀長較長、不需要片段間的拼接而直接獲得全長轉錄本信息,但測序成本相對要高很多,適合于沒有參考基因組信息生物的大規模基因分析[16-17]。這兩種轉錄組測序技術都有著廣泛應用,對于像玉米等有參考基因組信息的植物來說,二代測序就可以滿足一般的大規模基因表達分析需求。

本研究以耐高溫脅迫的中地88和不耐高溫脅迫的先玉335為材料,在不同溫度環境條件下取其花粉,通過二代轉錄組測序分析,獲得Hsf家族成員的基因轉錄表達信息,分析基因在不同材料和不同溫度處理的差異表達,探索玉米耐高溫脅迫的分子遺傳機制,為耐高溫脅迫相關基因的克隆利用奠定分子基礎。

1 材料與方法

1.1 玉米材料和溫度處理

本試驗選取2個玉米材料,包括耐高溫脅迫的中地88和不耐高溫脅迫的先玉335,種植環境設了大田和溫室2個處理,材料種植、田間管理和試驗取材在山西農業大學(山西省農業科學院)玉米研究所完成。

1.2 基因克隆

試驗設3次重復。取高溫(溫室42 ℃)和常溫(大田28 ℃)兩種生態環境下兩品種處于盛花期的花粉,液氮速凍保存,提取總RNA并分離純化mRNA,再經mRNA片段化下處理、cDNA合成、PCR富集、文庫質檢和測序分析(Illumina 測序平臺),獲得轉錄組高通量測序數據。從獲得的數據中搜尋Hsf轉錄因子家族成員信息,分析4種組合中呈現差異表達的Hsf家族成員,這4種組合為:先玉335高溫/先玉335常溫(A)、中地88常溫/先玉335常溫(B);中地88高溫/中地88常溫(C);中地88高溫/先玉335高溫(D)。

1.3 基因序列分析

對獲得的Hsf家族成員基因,根據其ID號,在網絡數據庫中(http://plants.ensembl.org/index.html)查找基因的全長及cDNA序列,分析其編碼蛋白的氨基酸序列。

1.4 蛋白理化性質分析

對Hsf家族成員基因表達蛋白的理化性質,通過網絡數據庫(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析完成,分析參數包括:基因的染色體分布、基因的外顯子數目、cDNA長度、編碼氨基酸數目、分子式、分子量、等電點及不穩定指數。

1.5 蛋白質結構預測

對Hsf家族成員基因表達蛋白的二級和三級結構分析,利用網絡在線分析軟件完成,網站分別為http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和https://www.swissmodel.expasy.org/。二級結構分析包含結構域名稱及數量、三級結構分析為參考網絡數據庫中的模板,利用其模型1預測其三維結構。

1.6 基因差異表達分析

根據read count的均一化結果,對上述A、B、C、D共4種組合進行分析,尋找差異表達的Hsf家族成員基因。差異基因入選條件為差異倍數Fold Change(Case/Control)大于2(即|log 2 Fold Change|>1),顯著性p<0.05。再統計不同組合中上調基因和下調基因的數目及其分布。

2 結果與分析

2.1 基因克隆及其編碼產物

根據轉錄組測序結果,在4種差異表達分析中,共得到15個差異表達Hsf家族成員基因,基因的名稱、ID號及編碼蛋白的氨基酸序列如表1所示,不同基因,其編碼蛋白含有的氨基酸數目不同,即蛋白質大小存在差異。這15個基因分布于玉米基因組的第1,3,4,5,6,7,8,9,10共9條染色體上(表2),分別各含有4,1,1,1,1,2,2,2,1個基因,在玉米第2染色體,沒有檢測到存在差異表達的Hsf轉錄因子基因。

表1 Hsf基因及其編碼蛋白的氨基酸序列

表2 Hsf基因在玉米基因組中的染色體分布

2.2 基因表達蛋白的理化性質

根據基因編碼蛋白的氨基酸序列,對這15個基因進行理化性質分析,結果如表3所示。除ZmHsf-07基因外,其余基因都為斷裂基因,且都含有2個外顯子。cDNA和編碼多肽鏈的長度各不相同,cDNA最長的為ZmHsf-15,達到1 410 bp,編碼469個氨基酸;最短的為ZmHsf-18,僅有774 bp,編碼257個氨基酸;這15個基因的cDNA長度平均為1 113.40 bp,編碼氨基酸的數目平均為370.13個。從cDNA長度、編碼氨基酸數目和分子量三列數據來看,這三者間呈正相關關系,即cDNA越長,編碼氨基酸數目越多,蛋白分子量也越高。等電點分析結果顯示,除ZmHsf-19大于7.00之外,其余的均小于7.00,即多數蛋白顯酸性。此外,從不穩定指數結果來看,這15個蛋白都屬于不穩定蛋白。

表3 Hsf基因編碼蛋白的理化性質

2.3 基因表達蛋白的二級結構

基因編碼蛋白的二級結構預測結果顯示,共包含四種二級結構,即螺旋區、轉角區、假想結構域邊界區和無規則卷曲區,總的來說,包括序列最多的為無規則卷曲區;最少的為假想結構域邊界區,只在ZmHsf-16基因編碼蛋白含有1個。這15個基因編碼蛋白含有的螺旋區和轉角區如圖1所示。對于螺旋區,最小的為ZmHsf-20和ZmHsf-27基因編碼蛋白,只有8個,最大的為ZmHsf-15,達到20個,平均為12.67個;對于轉角區,在這15個基因編碼蛋白中,變化幅度為2～7個,平均為4.06個。從圖1還可以看出,基因表達蛋白的二級結構中,螺旋區和轉角區數量沒有相關關系。

圖1 預測的Hsf家族蛋白成員的螺旋和轉角結構域的數量分布

2.4 基因表達蛋白的三級結構

基因表達蛋白三級結構預測結果如圖2所示。藍色末端為N末端,紅色末端為C末端。所有蛋白的三級結構都含有較多的螺旋區、轉角區和無規則卷曲區,不同蛋白具有不同的三級結構,總的來說,蛋白的氨基酸序列越長,則其結構越復雜。蛋白的三級結構與其在細胞中相應的生物學功能密切相關。

2.5 基因轉錄表達模式

根據材料和溫度的不同,分析了4種組合的差異比較(A:先玉335高溫/先玉335常溫;B:中地88常溫/先玉335常溫;C:中地88高溫/中地88常溫;D:中地88高溫/先玉335高溫),結果如表4所示。在A、B、C、D中,上調表達基因數量分別為9,5,8,5個,下調表達基因數量分別為1,2,1,2個。總的來說,上調表達基因數量要遠遠多于下調表達基因數量。有的基因會同時出現在不同的差異比較中,如ZmHsf-12在A、B和C中均表現為上調表達;ZmHsf-07,ZmHsf-08,ZmHsf-13和ZmHsf-17這4個基因在A和C中均表現為上調表達。也有個別基因比較特殊,如ZmHsf-18在A中上調表達,而在C和D中下調表達,ZmHsf-03在A中上調表達,但在D中又呈現出下調表達。從差異表達倍數的數據來看,不同基因在不同差異組合中數量不同,最小的剛超過2倍,最大的為無限大(此時分母為0)。

表4 玉米Hsf家族成員基因在不同溫度條件下的差異表達

3 討 論

隨著全球氣候變暖,高溫已成為影響玉米生長發育主要的非生物脅迫因素之一[18],通過玉米育性、灌漿、光合作用、體內代謝物、玉米籽粒淀粉含量等生長發育方面的影響,造成產量減少和品質下降[19]。當植株長期暴露在高溫缺水的環境下,為應對不利的生長環境,細胞內各種基因的表達時空模式也會隨之發生變化,而基因的表達與轉錄因子對基因轉錄的調控密切相關[20]。

轉錄因子是激活基因轉錄的一類重要的調控因子,通過特異性的識別并結合在啟動子的相應順式作用元件上,從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達[21]。轉錄因子在細胞中數量眾多,可以劃分為多個轉錄因子家族,每個家族又包括多個成員。在植物中,Hsf家族是一類非常重要的與溫度脅迫表達相關的蛋白質因子[22]。Hsf家族基因在動物中研究較多[23-24],在植物中的研究相對較少[25]。在熱脅迫條件下,有的基因表現為上調表達,有的基因則表現為下調表達,以應對不利的生態條件。

玉米作為全世界最重要的糧食作物之一,在其耐高溫脅迫研究中,主要是耐高溫脅迫玉米品種的常規法田間選育[26-27],而對其耐高溫脅迫的分子遺傳機制研究極少,在Hsf基因家族成員方面鮮有報道[28]。本研究通過耐高溫脅迫和不耐高溫脅迫的兩個玉米材料,在高溫和常溫處理條件下,對其花粉的轉錄組進行測序分析,篩選出了15個在不同組合比較間的差異表達基因,并對其基因的序列、表達蛋白的理化性質和結構以及基因的表達作了深入分析。總的來說,當以常溫條件為對照時,在高溫處理中多數基因表現為上調表達,如ZmHsf-07,ZmHsf-08,ZmHsf-13和ZmHsf-17,且差異倍數有的很大,甚至有的基因在常溫條件下沒有檢測到轉錄產物,而在高溫條件下卻有較高水平的表達,如ZmHsf-13;當以不耐高溫脅迫的先玉335為對照時,無論高溫還是常溫條件,多數基因都在中地88材料中表現為上調表達,僅有少數幾個基因表現為下調表達。這一結果表明這些基因的表達與溫度密切相關。

對于本研究獲得的15個Hsf基因,其表達模式為理解玉米耐高溫脅迫的分子遺傳機制提供了一些分子信息。目前已獲悉了基因的全長及cDNA序列,為后期對其功能作進一步鑒定奠定了基礎,也為其他植物Hsf家族成員基因的相關研究提供了參考。