油莎豆莖豆萌發過程中內源激素含量的變化

張向歌, 宋萬獻, 朱雅婧, 于美琴, 宋雯栩, 王樹峰, 李居政, 王會偉

(河南省農業科學院經濟作物研究所, 鄭州 450002)

油莎豆(CyperusesculentusL.)又名虎堅果、油莎草和鐵荸薺等,是一年生塊莖類植物,其地下莖塊呈圓形或橢圓形豆狀,可稱之為莖豆,富含油脂、淀粉、糖、蛋白質、膳食纖維以及多種維生素,應用于糧、油、牧、飼等多個方面,開發潛力巨大[1-3]。目前,油莎豆主要依賴于莖豆進行無性繁殖,其莖豆即為油莎豆繁育的種源。因而,保證油莎豆莖豆發芽率對油莎豆大面積推廣種植十分關鍵,開展油莎豆莖豆休眠與萌發相關的研究具有重要意義。

在種子的休眠與萌發過程中,植物內源激素起著非常重要的調控作用[4]。目前,內源激素脫落酸(ABA)和赤霉素(GAs)在種子休眠與萌發中的作用得到充分研究[5-6]。ABA和GAs作為主要的內源調控因子,以拮抗的方式調控種子的休眠和萌發;其中,ABA促進種子休眠并抑制萌發,而GAs則解除種子休眠并觸發萌發[7-8]。此外,近年來很多研究發現,其他內源激素如生長素、細胞分裂素、乙烯等對植物種子休眠與萌發均至關重要[9-11]。同樣,在無性繁殖植物中(如馬鈴薯、山藥等),其塊莖的休眠與萌發也受到各種內源激素的調控[12-13]。植物種子或莖豆從休眠到萌發的轉變過程不只是單一激素影響的結果,而與多種激素的共同作用密切相關。

種子萌發是指種子從吸脹作用開始的一系列有序的生理過程和形態發生過程。吸脹是種子萌發過程中極其重要的階段,隨著種子充分吸水,休眠性逐漸解除,其內源激素的含量也隨之呈現動態變化[14-15]。了解油莎豆莖豆在充分吸水前后內源激素含量的變化規律,有助于提高對油莎豆莖豆休眠與萌發的認識。本研究對油莎豆莖豆萌發過程中干莖豆、吸脹莖豆、初發芽莖豆進行內源激素GAs(GA1、GA3和GA4)、ABA、IAA、玉米素核苷(ZR)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)含量的測定,以明確油莎豆莖豆萌發過程中激素含量的變化規律,為油莎豆莖豆休眠與萌發調控機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為河南省油莎豆認定品種(2020年):圓粒型豫油莎2號,由河南省農業科學院經濟作物研究所選育。

1.2 萌發試驗

選取大小均勻一致的莖豆,用10%次氯酸鈉溶液消毒5 min,放入無菌水中進行浸種(3 d),每天更換一次無菌水。3 d后將吸脹的莖豆轉移至沙土育苗盤中進行發芽,設置3個重復,每個重復100粒,每天噴灑一次足量的無菌水。觀察莖豆萌發情況,統計莖豆發芽率。以上試驗均于河南省農業科學院人工氣候室進行,培養條件為光照14 h,30 ℃;黑暗10 h,28 ℃。

1.3 內源激素含量測定

選取干莖豆、浸種3 d莖豆、初發芽莖豆(芽長約0.5 cm),以芽眼為中心切取莖豆塊(約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm),設置3個重復,利用高效液相色譜法分別檢測以上各樣品中GAs、ABA、IAA、ZR、SA及JA等內源激素的含量。

內源激素的提取和純化參照相關研究并適當進行調整[16-17]。將樣品在液氮中研磨成粉末后準確稱取0.2 g(精確至0.001 g)于10 mL離心管中,加入2 mL經4 ℃預冷的80%(體積比)甲醇提取液(含0.5%甲酸),超聲萃取30 min,靜止過夜;在4 ℃條件下,12 000 r/min離心15 min,吸取上清液;再向殘渣中加入2 mL甲醇提取液,超聲萃取30 min,重復提取2次,合并3次上清液;在38 ℃恒溫水浴中旋轉減壓蒸發至水相,置-20 ℃冰箱中冷凍30 min;隨后取出解凍,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液于凈化管,劇烈振蕩30 s,4 000 r/min離心5 min,取上清液,用氮吹儀濃縮至干燥,加入1.0 mL乙腈溶液復溶,超聲30 s,0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液用于高效液相色譜儀檢測。以1%甲酸-甲醇為流動相溶劑系統,設定上樣量為10 μL,流速為0.5 mL/min,柱溫為30 ℃,依照梯度洗脫程序(表1)進行以上內源激素含量的測定。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序

1.4 外源激素處理

依據內源激素含量測定結果,選擇一些油莎豆莖豆萌發過程中出現明顯變化的激素,進行外源激素處理,以檢驗其對莖豆萌發的影響。將莖豆分別放入不同外源激素及對照(水)處理中浸種3 d,激素濃度參照萌發過程中最高檢測含量,每天更換一次相應的處理溶液;3 d后,將吸脹的莖豆轉移至沙土育苗盤中進行發芽,每個處理設3次重復,每個重復100粒,從莖豆發芽破土開始,每天觀察各處理中莖豆發芽情況,統計莖豆發芽個數并計算發芽率。

發芽率/%=(發芽個數/總莖豆數)×100%。

2 結果與分析

2.1 油莎豆莖豆萌發觀察及發芽率統計分析

油莎豆干莖豆浸種3 d后,莖豆充分吸水膨脹。將吸脹的莖豆放入沙土培養3 d后,莖豆開始逐漸發芽;沙土培養7 d后,幾乎所有莖豆發芽完成,而發芽較早的莖豆產生許多根系,葉片即將展開(圖1A)。通過統計分析,沙培7 d時莖豆的發芽率高達98.33%(圖1B),表明豫油莎2號莖豆芽點的活力較高,適合用于油莎豆莖豆萌發過程中內源激素含量的變化分析。

圖1 油莎豆莖豆萌發情況

2.2 內源激素GAs和ABA含量變化分析

在植物中,最常見的有生物活性的GAs是GA1、GA3和GA4。油莎豆莖豆萌發過程中(干莖豆-浸種3 d莖豆-初發芽莖豆)內源激素GA1、GA3和GA4的含量均出現了明顯變化,其中,GA1和GA4呈現逐漸上升,而GA3呈先上升后下降的變化趨勢(圖2)。在干莖豆中,GAs的含量均較低,GA1、GA3、GA4的含量分別為11.84 ng/g,3.87 ng/g,2.34 ng/g;在浸種3 d莖豆中,GAs的含量明顯上升,尤其是GA3的含量急劇上升至564.31 ng/g(約上升245倍);在初發芽莖豆中,GA1的含量進一步小幅度上升,而GA4的含量大幅度上升,達到169.70 ng/g;相反,GA3的含量急劇下降(圖2),表明GAs(尤其是GA3)的含量與油莎豆莖豆萌發呈密切正相關,而GA4可能在發芽后的生理變化中發揮著重要作用。相比之下,ABA的含量在休眠干莖豆中較高(364.59 ng/g),浸種3 d后急劇下降(11.72 ng/g),而在初發芽莖豆中又小幅度上升,即在莖豆萌發過程中呈先降后升的變化趨勢(圖2),與GA3恰好相反,表明ABA和GA3拮抗調控油莎豆莖豆的休眠和萌發進程。

圖2 油莎豆莖豆萌發過程中內源激素GAs和ABA含量的變化

2.3 內源激素IAA、ZR、SA和JA含量變化分析

IAA、ZR、SA和JA均是植物體內普遍存在的內源激素,參與多種生理過程調控。在油莎豆莖豆萌發過程中,IAA和JA的含量均呈先降后升的變化趨勢(圖3),與ABA的含量相似,在休眠的干莖豆中處于較高水平(分別為208.41 ng/g和332.40 ng/g),吸脹后急劇下降,莖豆解除休眠而開啟萌發進程;相反,ZR的含量則呈先急劇上升而后下降的趨勢(圖3),與GA3的一致,在干莖豆吸脹后達高水平狀態(218.04 ng/g),促進萌發進程;而SA的含量雖然呈逐漸下降的變化趨勢,但整體變化幅度較小且整體水平較低(圖3),可能不參與油莎豆莖豆萌發的調控。

圖3 油莎豆莖豆萌發過程中內源激素IAA、ZR、SA和JA含量的變化

2.4 外源激素處理對油莎豆莖豆萌發的影響

由上述分析可知,在油莎豆莖豆萌發過程中,從干莖豆到浸種3 d莖豆,GA3、ABA、IAA、ZR和JA的含量出現急劇變化。設置此5種激素濃度,GA3(564.31 ng/g)、ABA(364.59 ng/g)、IAA(208.41 ng/g)、ZR(218.04 ng/g)、JA(332.40 ng/g),對豫油莎2號莖豆進行外源激素處理,以檢驗其對莖豆萌發的影響。沙培4 d時,部分莖豆芽開始破土,ck處理條件下莖豆的發芽率為30.33%;相比之下,GA3和ZR處理條件下其發芽率增加,分別為41.33%和35.67%;而ABA、IAA和JA處理條件下其發芽率降低,分別為12.67%和16.67%(圖4)。同樣,沙培5 d時,與ck相比,GA3和ZR處理條件下發芽率增加而ABA、IAA和JA處理條件下發芽率降低(圖4)。沙培6 d時,GA3、ZR處理條件下所有莖豆發芽完成,發芽率達100%,ck達92.33%,而ABA、IAA和JA處理條件下莖豆發芽率分別為79.33%和80.00%(圖4)。由此表明,GA3和ZR能夠加快油莎豆莖豆的萌發速度,具有促進作用;而ABA、IAA和JA則相反,具有抑制作用。

圖4 外源激素處理下油莎豆莖豆發芽率的變化

3 結論與討論

植物種子或塊莖經過吸脹作用后,內源激素含量呈不同的變化趨勢,協同調控種子或塊莖的萌發與生長。大量研究表明,ABA和GAs是調控休眠與萌發的主導內源激素[5-8]。本研究發現,油莎豆干莖豆中ABA的含量較高,而GAs的含量較低;隨著莖豆充分吸水,ABA的含量急劇下降,而GA3的含量急劇上升;隨后,莖豆逐漸開始發芽,在初發芽莖豆中,ABA的含量出現小幅度上升,GA3的含量出現下降。可以看出,在油莎豆莖豆萌發過程中ABA和GA3出現了相反的變化趨勢,而且ABA含量的下降和GA3含量的上升促進了莖豆萌發。同時,外源激素處理結果顯示,GA3能夠加快油莎豆莖豆的萌發速度,而ABA則恰好相反。因此,與眾多研究一致,ABA和GA3以拮抗的方式分別抑制和促進油莎豆莖豆的萌發。另外,與GA3相比,GA1和GA4的含量同樣在油莎豆莖豆萌發過程中出現上升的趨勢,但GA1在干莖豆中的含量相對較高且在整個過程中呈現小幅度的變化,可能主要作用是維持莖豆的生命活力;而GA4在初發芽莖豆中的含量急劇上升,可能主要參與莖豆發芽后的生理變化調控。

本研究中,除了ABA和GAs之外,IAA、ZR、SA、JA含量也出現了變化。其中,IAA和JA含量的變化與ABA的一致,呈先降低后上升的趨勢。有研究發現,高濃度的IAA對種子的萌發具有抑制作用[18-20],而JA通過干擾過氧化酶的β氧化過程來抑制種子萌發[21-22]。另外,Liu等[23]發現,IAA通過激活ABA信號途徑促進擬南芥種子休眠而抑制萌發;Wang等[24]發現,ABA通過促進JA的生物合成來協同抑制水稻種子萌發。因而,可以看出IAA、JA和ABA一起協同抑制油莎豆莖豆的萌發。ZR是植物體內天然存在活性最強的細胞分裂素,能促進植物細胞分裂,保持細胞活力。Wang等[25]發現,細胞分裂素能夠下調ABA信號途徑中ABI5因子的基因表達,減弱ABA的抑制作用,從而使GA能夠促進擬南芥種子的萌發。本研究發現,ZR含量的變化與GA3的一致,呈先上升后降低的趨勢,表明ZR和GA3一起協同促進油莎豆莖豆的萌發。另外,SA是一種調節植物滲透能力的應激性激素,可以誘導植物抵抗生物和非生物脅迫[26-27]。大量研究發現,SA對鹽脅迫條件下草本植物種子萌發具有一定促進作用[28]。本研究中,SA含量較小,并且在整個莖豆萌發過程中出現小幅度下降的趨勢,表明SA對莖豆萌發過程影響較小。因而,在正常條件下,SA可能沒有參與萌發調控;而在一些脅迫條件下,SA可能被大量誘導合成,進而促進植物種子或塊莖的萌發。

綜上所述,油莎豆莖豆的萌發主要是ABA、GA3、IAA、ZR、JA等多種激素共同調控的結果,其中IAA、JA和ABA可以被稱為萌發抑制類激素,協同抑制莖豆萌發;而GA3和ZR可以被稱為萌發促進類激素,協同促進莖豆萌發。兩類激素之間的動態平衡,決定了莖豆的休眠與萌發,進一步深入探討各種激素之間的具體協同途徑,將有助于油莎豆莖豆休眠與萌發的調控機制解析。