水稻和陸稻分化相關性狀的QTL分析及水旱不同栽培條件下連續選擇的影響

孫 佩, 張培風, 李合順, 王學軍

(新鄉市農業科學院, 河南 新鄉 453000)

稻種的抗旱性是由多基因控制的數量性狀,與許多生理性狀、農藝性狀密切相關。因此,要對稻種抗旱性機理進行系統研究,必須對與抗旱性相關的主要農藝性狀進行QTL定位,分析各性狀對抗旱性的貢獻及遺傳方式。水稻株高、抽穗期、劍葉寬是多基因控制的數量性狀。Monna等[1],Sasaki等[2],Spielmeyer等[3]克隆了水稻綠色革命基因sd1,sd1位于1號染色體上,參與赤霉素的生物合成。Liu等[4]用秈粳組合IR64×Azucena的DH群體,共檢測到15個株高QTL,其中QTL1-15是主效QTL,其余的是微效QTL。王韻等[5]利用粳稻Lemont和秈稻特青相互導入構建的遺傳背景基本一致的雙向回交導入系群體,分別檢測到16個影響抽穗期的主效QTL和17個影響株高的主效QTL,鑒定出一些在不同遺傳背景和環境下穩定表達的主效QTL,如QHd3、QHd8a、QPh3和QPh4,適宜用于水稻抽穗期和株高的分子標記改良。馮玉濤等[6]利用金23B和CR071構建了BC3F1群體及其衍生的BC3F2群體,共定位到了12 個抽穗期相關QTL,8個株高相關的QTL,其中抽穗期和株高最大效應QTL均由CR07提供,且都定位于7號染色體同一位置。侯磊磊等[7]用粳型品種月之光與秈型品種明恢63的F2群體進行了抽穗期和株高的QTL定位分析,共定位到4個抽穗期QTL,分布于1,6,8,12號染色體上,8號染色體上的QHd8是主效基因,與已克隆的DTH8在相近位置,可能是DTH8;定位到4個與株高相關的QTL,分別位于1,3,8,12號染色體上,1號染色體上檢測到的qPH1是主效基因,位于矮稈基因sd1附近,可能是sd1。彭偉業等[8]以粳稻魔王谷和秈稻CO39組配的重組自交系為材料,檢測到12個控制劍葉形態性狀的QTL,分布于1,3,4,6,7,9號染色體上,只檢測到1個控制株高的QTL,位于1號染色體上,是一個主效 QTL。Lin等[9]利用BC4F2群體和BC4F3群體精細定位到影響抽穗期的QTL:Hd9位于3號染色體短臂(C721-R1468B)。譚祿賓等[10]以中國云南元江普通野生稻與秈稻品種特青構建的BC3F2群體和BC3F3群體,檢測到6個控制抽穗期的QTL,分別位于1,3,7,8,11號染色體上。董國軍等[11]以劍葉角度差異顯著的秈稻窄葉青8號和粳稻京系17構建DH群體為材料,分別在1,2,3,12號染色體上檢測到4個劍葉角度QTL。張向陽等[12]利用秈稻材料千粒稻與粳稻材料日本晴構建的F2群體檢測到3個劍葉寬QTL,分別位于1,2,7號染色體上。

大約在一萬年前,人類社會就已經開始從單純的狩獵和采集型向農業型轉變,并且在四千年前,古代人類就已經完成了所有主要作物的馴化。經過漫長的自然選擇和人工選擇,栽培稻發生了一系列農藝性狀和生理特性上的重大改變,形成了品種類型復雜、栽培要求不一的生態類型[13]。

本研究以云南地方品種(水稻和陸稻作親本)所構建的RIL9群體進行抗旱性相關農藝性狀的QTL定位,為認識這些性狀的遺傳方式提供理論依據和實踐基礎。雙親所構建的F2群體通過Bulk方法進行繁殖,從F4代開始水、旱田兩種栽培方式連續選擇5代,分別得到CA、CB兩個群體,調查抗旱性相關的農藝性狀,以闡明人工選擇的影響,為抗旱育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雙親為云南省石林彝族栽培稻田Ch55群體中的2個個體:Ch5-10和Ch6-11(OryzasativaL.)。Ch5-10(母本、水稻、偏秈性)田間表現為莖稈粗壯、分蘗力較強、抽穗期較長。Ch6-11(父本、陸稻、偏粳性)田間表現為莖稈細弱、分蘗力較弱、抽穗期較短。雙親植株均高大繁茂,但株高差異明顯。

雙親所構建的F2群體利用SSD方法得到RIL9群體(113個株系),進行QTL分析。

雙親所構建的F2群體利用Bulk方法進行繁殖。F4代開始進行水、旱田兩種條件下種植。經過5代的篩選后,繁殖成株系,分別得到CA(289個株系)和CB(332個株系)兩個群體。

1.2 表型鑒定

RIL9群體:試驗于2009年分別在中國農業大學北京上莊試驗站和安徽省農業科學院水稻研究所(合肥)進行,2010年在中國農業大學北京上莊試驗站進行。主要考察始穗期、株高、劍葉寬等3個性狀,每個株系選取有代表性的10株調查。

CA、CB群體:試驗于2009年分別在中國農業大學北京上莊試驗站和安徽省農業科學院水稻研究所(合肥)進行。主要考察最高分蘗數、有效分蘗數、始穗期、株高和劍葉寬等5個性狀,每個株系選取有代表性的10株調查。

按照30 cm×30 cm的規格種植,每個株系各種植2行,每行12株,田間管理同常規大田。評價標準如下:

最高分蘗數:在拔節期間隔一周調查分蘗數,確定最高峰時的分蘗數。

有效分蘗數:在黃熟期時調查有效分蘗數(包括主莖),凡未抽穗或抽穗而不結實的為無效分蘗。

始穗期:10%的穗頂部露出劍葉鞘時為始穗期。

株高:黃熟期時,測量單株自地面到穗頂(不連芒)的高度(每株株高以該株最高穗的高度為準)。

劍葉寬:黃熟期時,主莖劍葉寬。

1.3 DNA提取及SSR分析

參照Rogers等[14]的CTAB法略加改動提取DNA。利用從Panaud等[15]、Chen等[16],Temnykh等[17]和McCouch等[18]所構建的高密度水稻連鎖圖譜中選出均勻覆蓋12條染色體的660對SSR標記,及Wang等[19]開發的20對ILP標記,檢測雙親多態性。

1.4 遺傳圖譜的構建及QTL分析

利用Map Manager QTXb20軟件(Manly等[20];http://mapmgr.roswellpark.org/mmQTL.html)區間作圖法進行分析。遺傳圖譜包括115對SSR標記及8對ILP標記。取概率值小于0.01作為判斷QTL存在的閾值。采用SPSS17.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 RIL9群體的QTL定位分析

2.1.1RIL9親本及群體的表型變異與相關性分析

由表1可知,在始穗期方面,雙親在北京地區種植差異明顯,Ch5-10和Ch6-11在2009年分別為119.0 d和80.0 d,2010年分別為123.0 d和90.0 d。雙親在安徽地區種植差異較小,Ch5-10和Ch6-11在2009年分別為98.0 d和95.0 d。雙親2009年北京劍葉寬差異達到極顯著水平,Ch5-10和Ch6-11分別為1.6 cm和1.4 cm,2010年北京劍葉寬雙親間差異不顯著,均為1.8 cm。株高雙親間差異達到極顯著水平,2009年北京Ch5-10和Ch6-11分別為179.4 cm和128.9 cm,2009年安徽Ch5-10和Ch6-11分別為190.0 cm和160.0 cm,2010年北京Ch5-10和Ch6-11分別為200.5 cm和146.7 cm。從分離群體變異的分布范圍來看,各性狀均出現一定數量的超親類型,而且多數是雙向超親分離。經單樣本K-S檢驗,各性狀均符合正態分布。

表1 親本及RIL9群體的表型統計結果

田間表型間相關性如表2所示。極顯著正相關的性狀有20對,包括始穗期×株高、始穗期×劍葉寬、株高×劍葉寬;顯著正相關的性狀有2對,包括2009年安徽始穗期×2009年北京株高、2010年北京株高×2010年北京劍葉寬。

表2 田間表型的相關性分析

2.1.2遺傳圖譜的構建

本研究挑選均勻覆蓋水稻基因組的680對標記檢測雙親多態性。在作圖群體中能穩定擴增出多態性條帶并最終統計數據的有123對,構建了覆蓋水稻12條染色體的遺傳連鎖圖,部分染色體見圖1。各染色體多態性標記數為6(10號染色體)～16對(3號染色體)。

圖1 檢測到的QTL在染色體上的分布

2.1.3QTL分析

3個性狀共檢測到19個QTL(p<0.01),分布于1,2,3,7,8,9,11號染色體上。2010年北京始穗期的QTL最多,為4個。2009年北京劍葉寬的QTL最少,為1個。各性狀QTL的數目和位置、效應見表3和圖1。

表3 QTL分析結果

始穗期:2009年在北京種植的群體共檢測到2個QTL,分別位于3號和7號染色體上。qHD-3-1位于3號染色體RM523-RM231標記區間,LOD值為3.4,貢獻率為15%。qHD-7位于7號染色體RM214-RM432標記區間,LOD值為2.9,貢獻率為11%。同時,對2009年在安徽合肥種植的群體分析共檢測到了2個QTL,分別位于3號和7號染色體上。qHD-3-2位于3號染色體RM231-RM489標記區間,LOD值為4.7,貢獻率為18%。qHD-7位于7號染色體RM214-RM432標記區間,LOD值為3.2,貢獻率為12%。對2010年在北京種植的群體進一步分析,結果表明,在這一環境中檢測到4個QTL,分別位于3,7,8號染色體上。qHD-3-1位于3號染色體RM231-RM489標記區間,LOD值為3.2,貢獻率為12%。qHD-7位于7號染色體RM214-RM432標記區間,LOD值為2.6,貢獻率為10%。qHD-8-1和qHD-8-2分別位于8號染色體RM531～RM210和RM210-RM308標記區間,LOD值分別為2.8和2.5,貢獻率分別為11%和10%。

綜合以上結果表明,qHD-7可以在 3個不同的生長環境中穩定表達。3號染色體的位點為主效QTL,但穩定性較差,表現為2009年安徽和2010年北京結果一致,2009年北京檢測到的位置在相鄰區間。3號和7號染色體的QTL均表現為來自親本Ch5-10的基因增加始穗期。2010年北京在第8染色體檢測到的2個QTL表現為來自親本Ch6-11的基因增加始穗期。

株高:2009年在北京種植的群體共檢測到4個QTL,分別位于1,3,9,11號染色體上。qPH-1位于1號染色體RM319-RM3290標記區間,LOD值為4.4,貢獻率為16%。qPH-3位于3號染色體RM231-RM489標記區間,LOD值為2.6,貢獻率為10%。qPH-9位于9號染色體RI05077-RM409標記區間,LOD值為2.4,貢獻率為9%。qPH-11位于11號染色體RM287-RM229標記區間,LOD值為2.4,貢獻率為10%。同時,對2009年在安徽合肥種植的群體分析共檢測到了3個QTL,分別位于1,2,3號染色體上。qPH-1位于1號染色體RM319-RM3290標記區間,LOD值為6.2,貢獻率為22%。qPH-2-1位于2號染色體RM318-RM5472標記區間,LOD值為2.4,貢獻率為9%。qPH-3位于3號染色體RM231-RM489標記區間,LOD值為2.4,貢獻率為9%。對2010年在北京種植的群體進一步分析,結果表明,在這一環境中檢測到3個QTL,分別位于1,2,3號染色體上。qPH-1位于1號染色體RM319-RM3290標記區間,LOD值為4.4,貢獻率為16%。qPH-2-2位于2號染色體RM450-RM318標記區間,LOD值為2.6,貢獻率為10%。qPH-3位于3號染色體RM231-RM489標記區間,LOD值為2.5,貢獻率為10%。

綜合以上結果表明,qPH-1為主效QTL,qPH-1和qPH-3可以在 3個不同的生長環境中穩定表達。其他的位點均表現為只在某一環境中表達,穩定性差。各QTL均表現為來自親本Ch5-10的基因增加株高。

劍葉寬:只在一種環境中檢測到QTL(2009年北京),qFLW-1位于1號染色體RM283-RM522標記區間,LOD值為3.2,貢獻率為12%。表現為來自親本Ch5-10的基因增加劍葉寬。

2.2 CA和CB群體水旱不同栽培條件下連續選擇的影響

2.2.1CA和CB親本及群體的表型

由表4可以看出,在最高分蘗數方面,雙親在2009年北京地區種植差異達到極顯著水平,Ch5-10和Ch6-11分別為19.8個和14.0個。在有效分蘗數方面,雙親在2009年北京地區種植差異不顯著,Ch5-10和Ch6-11分別為8.6個和8.1個,其他性狀雙親之間差異水平同表1。群體中各性狀基本符合正態分布,CA群體和CB群體間做t檢驗檢測,發現2009年安徽始穗期和2009年北京劍葉寬差異不顯著,其他性狀差異均達到極顯著水平。

表4 親本及CA、CB群體的表型統計結果

對CA群體和CB群體各性狀平均數作比較,北京最高分蘗數:CA>CB;北京始穗期:CA>CB;北京有效分蘗數:CA>CB;北京劍葉寬:CA=CB;北京株高:CA

2.2.2農藝性狀的因子分析

本研究運用SPSS17.0軟件進行農藝性狀的因子分析。按照特征根大于1.00的原則,提取3個主因子,其累積貢獻率達74.2%,即反映了原有信息的74.2%。將這3個主因子作為評價綜合變量。貢獻率分別為28.1%,23.9%和22.1%。

表5是因子旋轉成分矩陣,提取方法為主成分分析法,旋轉法為具有Kaiser標準化的正交旋轉法。第一個因子對北京始穗期、安徽始穗期和北京劍葉寬有絕對值較大的負荷系數,第二個因子對北京株高和安徽株高有絕對值較大的負荷系數,第三個因子對北京最高分蘗數和北京有效分蘗數有絕對值較大的負荷系數。根據因子分析結果作散點圖(圖2),可以看出CA、CB兩群體經過5代的水、旱田篩選,最高分蘗數、始穗期、有效分蘗數、劍葉寬、株高有明顯差異。

圖2 CA、CB群體的因子分析

表5 旋轉成分矩陣

2.2.3基因型分析

根據RIL9群體的QTL定位結果[21],選擇qSLtr-2、qSLratio-2、qRL28-2-1和qRL28-4附近的標記RM166、RM5472、RI05751和RM5979,及未定位到QTL的對照標記RM259對CA群體和CB群體進行基因型分析,兩群體間t檢驗結果表明,RM5472、RI05751和RM5979均達到極顯著水平,RM259和RM166差異不顯著。其中,RM166差異不顯著,可能是RM166-RM5472區間較大,RM166與QTL位點距離較遠所致。

3 結論與討論

本研究以來自云南的地方品種Ch5-10(母本、水稻、偏秈性)和Ch6-11(父本、陸稻、偏粳性)為親本,后代用SSD方法而得到的RIL9群體為試驗材料,對水陸稻差異性狀(始穗期、劍葉寬、株高等)進行了考察。并利用SSR分子標記構建連鎖圖譜,進行了上述性狀的QTL定位。雙親雜交得到F2代,后代用Bulk方法進行繁殖。F4代開始對Bulk群體進行水、旱田兩種條件種植。經過5代的篩選后,繁殖成株系,分別得到CA、CB兩個群體。對水陸稻差異性狀(始穗期、最高分蘗數、有效分蘗數、劍葉寬、株高)進行考察。

水稻株高的QTL定位研究表明,1號染色體上與sd1基因處于相同位置的QTL最常被檢測到,效應值也較大[1-3]。本研究株高主效QTL:qPH-1與sd1位置相近。Liu等[4]利用一套來源于秈粳組合IR64×Azucena的DH群體定位到的株高QTL位點qPH-2-11與本研究qPH-2位置一致。王韻等[5]利用粳稻Lemont和秈稻特青相互導入構建的遺傳背景基本一致的雙向回交導入系群體,定位到的株高QTL位點qPH-2與本研究qPH-2位置一致。馮玉濤等[6]利用金23B和CR071構建的BC3F1群體及其衍生的 BC3F2群體,定位到的株高QTL位點qPH9與本研究結果qPH-9位置一致。侯磊磊等[7]利用粳型品種月之光與秈型品種明恢 63的F2群體定位到的株高QTLqPH1和qPH3與本研究結果qPH-1和qPH-3位置一致。彭偉業等[8]以粳稻魔王谷和秈稻 CO39 組配的 280 個重組自交系為材料,定位到的株高QTLqPH1與本研究結果qPH-1位置一致。姜雪等[22]利用矮稈品種“V20B”和高稈品種“CPSLO17”作為親本,構建了150個重組自交系家系(RILs),結合SLAF_seq技術構建的水稻高密度遺傳圖譜,對水稻株高進行QTL檢測。在1號和6號染色體各檢測到2個株高QTL位點,其中qPH1-2對表型變異的貢獻率為22.2%,位于sd1基因附近,與本研究qPH-1位置一致。

馮玉濤等[6]利用金23B和CR071構建的BC3F1群體及其衍生的 BC3F2群體,定位到的抽穗期QTL位點qHD7與本研究結果qHD-7位置相近。Lin等[9]利用BC4F2群體和BC4F3群體精細定位到影響抽穗期的QTL:Hd9與本研究QTL定位結果qHD-3-1位置一致;譚祿賓等[10]以中國云南元江普通野生稻與秈稻品種特青構建的BC3F2群體和BC3F3群體,檢測到的位于3號染色體RM22附近的抽穗期QTL位點與本研究QTL定位結果qHD-3-1位置一致。趙凌等[23]利用抽穗期存在明顯差異的粳稻TD70和秈稻Kasalath雜交衍生的包含186個家系的重組自交系群體,構建了基于深度重測序的高密度Bin遺傳圖譜,對控制水稻抽穗期的QTL進行鑒定,其中qHD3與本研究qHD-3-1位置一致。

董國軍等[11]以劍葉角度差異顯著的秈稻窄葉青8號和粳稻京系17構建DH群體為材料,檢測到的劍葉角度QTL的qFLA-1與本研究劍葉寬QTL定位結果qFLW-1位置相近。王小雷等[24]利用秈稻昌恢121和粳稻Koshihikari構建的208個染色體片段置換系對控制株高、劍葉形態和分蘗數的QTL進行檢測,其中株高QTL的qPH-1-2與本研究qPH-1位置一致,葉寬QTL的qFLW-1與本研究qFLW-1位置一致。

陸稻親本Ch6-11始穗期較短、分蘗數較少、劍葉寬偏窄、株高偏低,這些都表現為植株對干旱環境的一種適應性和積極的反應。從表2可以看出,始穗期的QTL的加性效應有正有負,表明了來自雙親的等位基因對這些性狀值都有增效作用。等位基因聚合在一起互作,部分解釋了群體的超親分離現象。兩個性狀雙親的等位基因分布于不同染色體上,這為進行標記輔助選擇和基因聚合育種提供了條件。聚集在一起的QTL可能表現為“緊密連鎖”,也可能表現為“一因多效”[25]。例如3號染色體的RM231-RM489的區間內聚集著株高和始穗期在不同環境下檢測到的5個QTL。CA、CB群體經過5代的水、旱田環境篩選之后,最高分蘗數、有效分蘗數、始穗期、株高、劍葉寬有明顯差異。說明兩群體的表型和基因型都受到了人工選擇的影響。