三葉木通種子形態(tài)、解剖及萌芽生物學特性的研究

趙小琴, 曹運梅, 段佳欣, 蔡小東

(1.長江大學園藝園林學院/香辛作物研究院, 湖北 荊州 434025;2.荊州佳之源生物科技有限公司, 湖北 荊州 434025)

三葉木通(Akebiatrifoliata)為木通科木通屬多年生落葉木質藤本植物,因其果實于陰歷八月縱向炸開,也被稱為八月瓜、八月炸[1]。三葉木通分布廣泛,野生資源常集中于熱量豐富、降水充沛、濕度較高、日照時間相對較短的區(qū)域[2],在貴州、陜西、湖南、河南等省份人工種植已規(guī)模化[3]。三葉木通兼有藥用、食用、觀賞及園林應用價值,其果皮、果肉、種子具有多種用途,是一種開發(fā)前景廣闊的特色經濟植物[4-5]。三葉木通作為傳統(tǒng)中草藥已有2 000多年的歷史,具有抗癌、抗炎、抗腫瘤和抗風濕等藥用價值[6-7]。果實富含氨基酸、蛋白質、可溶性糖、有機酸和多種礦物質,口感細膩而甘甜,可作為藥食兼用的新型水果進行開發(fā)[4-5]。種子脂肪酸含量較高,且以中油酸、亞油酸以及棕櫚酸等不飽和脂肪酸為主,可作為新型油料作物利用[8]。此外,三葉木通莖蔓柔軟多姿,花和果實具有一定的觀賞價值[4-5]。

種子生物學特性及萌芽特性研究是種子繁殖及種質保存的基礎[9-11]。三葉木通果實種子數(shù)量多,但種皮內含有大量油脂、天然膠,蠟質化程度較高,野生環(huán)境中種子發(fā)芽率較低,野外調查中很少發(fā)現(xiàn)實生小苗[12]。近年來,三葉木通已進軍中國高端水果市場,野生資源產量難以滿足市場需求,亟需人工大量繁殖良種苗木[13]。另一方面,人類活動導致三葉木通生長環(huán)境惡化,野生資源流失日益嚴重,三葉木通資源的收集、保存和管理亟待加強[1,12]。一般而言,種子保存是植物種質資源長期保存最理想的方式。根據(jù)種子的貯藏特性,可將種子分為正常型種子、頑拗性種子和中間型種子,這三種類型種子的特征差異較大,對水分敏感性、貯藏條件均不相同[4,14]。正常型種子種胚發(fā)育成熟后脫水耐性強,在一定程度上能承受脫水而不影響種子的活力和發(fā)芽率[4]。而頑拗性種子在脫水過程中,由于其脫水耐性差,導致種子發(fā)芽率不斷下降,直至活力喪失[14]。

目前,對三葉木通的研究主要集中于野生資源調查、營養(yǎng)成分、藥用成分等方面[2,6-7],而對三葉木通種子的生物學特性如種子的形態(tài)結構、形成和發(fā)育、休眠與萌芽特性等方面研究較少[15-16]。因此,本研究從三葉木通種子的形態(tài)及解剖特征、吸水率、發(fā)芽條件、脫水敏感性等方面進行系統(tǒng)研究,旨在為三葉木通種子繁殖及種質資源保存提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生三葉木通成熟果實采自貴州省鎮(zhèn)遠縣三葉木通自然分布區(qū),室內常溫放置一周后從果瓤中分離種子并反復搓洗干凈,于陰涼通風處晾干后立即進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1種子基本形態(tài)特征觀測

隨機挑選飽滿的三葉木通種子,在解剖鏡下觀察其形狀、顏色、光澤及表皮等特征。隨機取50粒新鮮種子,采用游標卡尺(精度0.01 mm)分別測量種子的長度、寬度、厚度,重復3次。

1.2.2種子千粒重的測定

參照農作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543-1995)[17],采用百粒重法測定三葉木通種子千粒重。隨機挑選100粒種子,用萬分之一電子天平稱其重量,重復8次后取其平均值,換算成千粒重。

1.2.3種胚長度的測量

隨機取15粒新鮮種子,用手術刀將種子沿縱軸切開,用解剖針將種胚剝出,在體視顯微鏡下測量種胚長度,計算種胚長度/種子長度比值,重復3次。

1.2.4種胚的解剖觀察

選取三葉木通外觀飽滿的種子,去除外種皮后固定于FAA固定液中,采用常規(guī)石蠟切片法制作樣品切片[18]。切片厚度10 μm,采用甲苯胺藍O (Toluidine blue O,TBO )染色,在ECLIPSE NI-U顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

瀝青質量直接影響混合料質量，應選用具有良好溫度敏感性、抗老化性，含蠟量低的優(yōu)質瀝青。本文采用70#道路石油瀝青，其主要技術指標如表4所示。

1.2.5種子吸水率的測定

取大小一致、種粒飽滿的新鮮種子分成2份,一份種子保留完整種皮,另一份自胚根端用刀片切除少量部分,得到破皮種子。兩個處理種子分別稱重,在25 ℃恒溫條件下于蒸餾水中浸泡1,3,5,7,9,11,24,48 h后分別取出,濾紙吸干種子表面水分后用分析天平稱其重量,直至種子恒重。計算其吸水率,以此分析種皮的透水性。每個處理重復3次,每個重復30粒種子。

吸水率/%=[(浸泡后質量-浸泡前質量)/浸種前質量]×100%。

1.2.6種皮對種子萌發(fā)的影響

采用培養(yǎng)皿發(fā)芽方式。選取顆粒飽滿、均勻一致的新鮮種子,0.1% KMnO4浸泡30 min后用無菌水沖洗3次,用濾紙吸干表面水分后分成2份,一份種皮完整,另一份進行破皮處理。分別將2種處理種子放置于預先平鋪雙層濾紙的無菌玻璃培養(yǎng)皿內,每培養(yǎng)皿放置15粒種子,種子均勻平放于濾紙上,加入蒸餾水使其充分濕潤。種子處理好后置于人工氣候箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃,相對濕度70%,每天光照12 h。在培養(yǎng)過程中,每隔3 d噴灑適量無菌水以確保種子處于濕潤狀態(tài),每天觀察并記錄種子萌發(fā)狀況,連續(xù)5 d沒有種子發(fā)芽則結束調查。發(fā)芽標準為胚根突破種皮并生長至種子長度的1/2以上。每個處理60粒種子,3次重復。

發(fā)芽率/%=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.7不同溫度對種子萌發(fā)的影響

采用濕沙層積催芽方式。試驗前三葉木通新鮮種子用0.1% KMnO4消毒30 min,用無菌水沖洗3次。將種子均勻平鋪于高溫高壓滅菌后的濕沙(含水量約60%)中,之后再覆蓋一層濕沙,定期噴灑適量無菌水以確保沙子處于濕潤狀態(tài)。層積溫度分別設置4 ℃、8 ℃、16 ℃、25 ℃等4個處理,每個處理30粒種子,3次重復。中層積至第30天時分別統(tǒng)計各處理溫度種子的發(fā)芽率。

1.2.8脫水時間對種子活力的影響

采用硅膠干燥法對三葉木通種子進行脫水處理,具體操作為:在玻璃干燥器底部放一層硅膠(厚約3 cm),將三葉木通新鮮種子平鋪于硅膠上,然后再平鋪一層厚約4 cm的硅膠。分別在脫水處理的0,4,8,12,24,48,96 h時取樣,采用TTC法測定種子活力。具體方法如下:用手術刀沿種子縱軸切開,取其中種胚保留完整的一瓣浸入0.2% TTC溶液中,置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中避光染色12 h,染色結束后用蒸餾水沖洗3次,觀察胚的染色情況,統(tǒng)計新鮮種子活力。每處理30粒種子,重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel2010軟件進行整理。吸水率、發(fā)芽率、種子活力數(shù)據(jù)進行反正弦轉換后,采用SPSS23.0軟件對不同處理種子的吸水率和發(fā)芽率進行雙因素方差分析,脫水處理后種子活力進行鄧肯多重比較檢驗。

2 結果與分析

2.1 三葉木通種子的形態(tài)及解剖特征

本研究中采收的成熟三葉木通果實呈長橢圓形,果皮為紫色,具有不規(guī)則深皺紋,腹縫線為白色(圖1A)。果肉為白色或淡黃色,種子數(shù)較多(圖1B)。種子為扁長橢圓形或扁橢圓形,外表皮為黑褐色,有光澤(圖1C)。種子由種皮、種阜、胚乳、胚等4部分組成,種胚較小,有發(fā)達的白色胚乳,基部鈍圓,種臍端有一個突起的白色種阜(圖1D)。從三葉木通種子縱切面解剖結構可以看出,種胚由子葉、胚軸、胚芽、胚根組成,種胚直生于基部,呈棒狀,已分化出2片子葉(圖1E)。

注:A、B為果實外觀及縱切特征;C與D分別為種子外觀及縱切結構;E為種子縱切面顯微結構。1為胚;2為胚乳;3為種皮;4為種阜;EN為胚乳;CO為子葉;PL為胚芽;EA為胚軸;RA為胚根。

由表1可知,三葉木通種子平均千粒重為62.29 g,平均長度、寬度、厚度分別為8.62 mm、5.80 mm、3.21 mm,種胚平均長度為3.01 mm,平均種胚長度/種子長度為0.35,說明三葉木通種子的胚所占比例較小。這些指標的變異系數(shù)在6.79%～11.61%之間,其中種胚長度/種子長度、千粒重、種胚長度、種子厚度的變異系數(shù)均超過10%,表明三葉木通種子的形態(tài)差異較大。

表1 三葉木通種子的基本特征

2.2 種皮對種子吸水率的影響

如圖2所示,種皮完整種子與種皮破損種子的吸水趨勢基本一致,均呈現(xiàn)先快速上升后趨于平緩的趨勢。破皮處理種子浸種前3 h吸水率急劇上升,3 h后吸水率上升稍緩,11 h后種子吸水速率逐漸趨于平緩,直至達到飽和。而種皮完整種子在0～5 h內吸水率增加較快,5～11 h期間吸水率上升趨勢變緩,11 h后種子吸水量逐漸變小。總體而言,在整個浸種過程中,種皮破損種子吸水率明顯高于種皮完整種子,浸種后前11 h種皮破損種子及種皮完整種子的吸水量分別占總吸水量的73.21%和61.70%。方差分析結果(表2)表明,種皮完整與否及浸泡時間均對種子吸水率有極顯著影響,而種皮完整與否與浸泡時間的互作對種子的吸水率沒有顯著影響。這些結果表明,三葉木通種子的種皮對種子吸水有極顯著阻礙作用,破皮處理、延長浸泡時間有利于種子對水分的吸收。

圖2 三葉木通種子的吸水特性

表2 種皮對三葉木通種子吸水率的影響

2.3 種皮完整與否對種子萌發(fā)的影響

種皮對三葉木通種子發(fā)芽率的影響如圖3所示。當培養(yǎng)至第5天時,種皮破損種子中已觀察到少量種子開始萌芽,發(fā)芽率達到1.97%,而種皮完整種子直至第10天時才有個別種子發(fā)芽。隨著培養(yǎng)時間的延長,種皮破損種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)明顯增加的趨勢,至第30天時78.97%的種子已發(fā)芽,在整個試驗過程中其發(fā)芽率均遠高于種皮完整種子。而種皮完整種子的發(fā)芽率在0～25 d內一直較低,直至培養(yǎng)至第30天時才達到17.81%。根據(jù)方差分析結果(表3)可知,種皮完整與否、培養(yǎng)時間及二者的互作效應均對三葉木通種子發(fā)芽率有極顯著影響。這些結果表明,種皮對三葉木通種子發(fā)芽有明顯的抑制作用,破皮處理并適當延長培養(yǎng)時間能極顯著提高種子的發(fā)芽率。

圖3 種皮對三葉木通種子發(fā)芽的抑制作用

表3 種皮對三葉木通種子發(fā)芽率的影響

2.4 不同溫度對種子萌芽的影響

三葉木通種子濕沙層積30 d后,溫度對發(fā)芽率的影響如圖4所示。4種溫度處理下種子發(fā)芽率依次為:16 ℃(80.87%)>25 ℃(73.03%)>8 ℃(69.57%)>4 ℃(60.03%)。顯著性分析結果顯示,16 ℃層積處理種子的發(fā)芽率顯著高于低溫處理(4 ℃和8 ℃),但與高溫層積處理(25 ℃)之間沒有顯著差異;25 ℃處理種子的發(fā)芽率顯著高于4 ℃,但與8 ℃處理之間沒有顯著差異。因此,可認為16 ℃濕沙層積處理是三葉木通種子催芽的理想方式。此外,4 ℃低溫處理30 d時發(fā)芽率也高達60.03%,表明三葉木通種子萌芽受低溫影響較小。

圖4 不同溫度下三葉木通種子的發(fā)芽率

2.5 脫水時間對種子活力的影響

不同硅膠干燥時間對種子活力的影響如圖5所示。三葉木通新鮮種子經TTC染色后,其種胚和胚乳呈深紅色,活力高達94.43%。隨著硅膠處理時間不斷延長,種子活力逐漸下降。干燥前12 h種子活力下降速度較慢,處理至第12小時時種子活力下降至76.42%,與新鮮種子相比活力下降了18.01%。硅膠干燥處理24 h時種子活力僅為46.25%,而脫水至48 h時活力降至16.90%。48 h后種子活力下降速度減緩,當種子脫水至第96小時時,種子活力僅有11.2%,此時TTC染色后的種胚已呈白色。由此可知,三葉木通種子的活力隨脫水時間的延長而減少,特別是在12～48 h硅膠干燥處理間。

圖5 脫水時間對三葉木通種子活力的影響

3 討 論

研究種子生物學特性可為野生資源的繁殖、保存、引種馴化和品種改良奠定基礎[9-11]。種子的表型特征主要包括大小、形狀、種皮顏色、質地等,同一地區(qū)、同一品種的種子其形態(tài)結構常存在差異,很多性狀可作為鑒別植物種類和品種的依據(jù),如種子的大小、形狀、顏色、種子表面的光滑度、胚和胚乳的比值等[10-11]。本研究所用三葉木通采摘于貴州省鎮(zhèn)遠縣同一自然分布區(qū),但結果發(fā)現(xiàn)種子的形態(tài)指標變異系數(shù)較大,尤其是種胚長度/種子長度、千粒重、種胚長度、種子厚度。熊大勝等[16]研究表明,三葉木通種子有較明顯的形態(tài)后熟過程。本試驗三葉木通種子來自于完全成熟且室溫放置一周的果實,解剖結構顯示,三葉木通種子種胚已分化出2片子葉,但無論是采用培養(yǎng)皿發(fā)芽方式還是濕沙層積催芽方式,種子均不能立即萌發(fā),表明其種胚未完全發(fā)育成熟。

種子萌發(fā)受水分、溫度、氧氣等諸多外界生態(tài)環(huán)境影響,也與自身因素諸如種皮限制、抑制物等休眠因素有關[19-20]。三葉木通種子存在輕度種皮障礙引起的休眠現(xiàn)象[15-16],用茶葉或草木灰液浸種、濕沙層積等措施可促進種子發(fā)芽。通過比較破皮種子和完整種子的吸水率和萌芽率,發(fā)現(xiàn)三葉木通種子存在種皮障礙,從而極顯著降低了種子吸水率,抑制了種子的萌發(fā)。展曉日等[21]研究發(fā)現(xiàn),三葉木通種子表皮細胞下方有7～8 層厚壁細胞,種皮外層細胞的細胞壁3 面增厚且木質化,這可能是三葉木通完整種子吸水率低的解剖學原因。通過破皮處理,可顯著提高三葉木通種子的吸水率和發(fā)芽率。在對葉百部[19]、酸棗[10]等其他種皮堅硬的物種研究中,破除種皮障礙后種子的發(fā)芽率也得到了顯著提高。此外,種子休眠與萌芽特性因物種而異,層積處理是解除種子休眠、促進種子萌發(fā)的常見方法之一[9,20,22]。層積處理可軟化種皮,提高種皮透性,促進種胚后熟過程,有效降低種子中抑制物質的含量[20,22]。濕沙層積30 d后,三葉木通完整種子的發(fā)芽率明顯高于培養(yǎng)皿發(fā)芽方式。一些研究[9,20]表明,層積溫度對種子的發(fā)芽率有明顯的影響。本研究發(fā)現(xiàn),濕沙層積溫度對三葉木通種子發(fā)芽率有顯著的影響,但三葉木通種子萌發(fā)對溫度適應性較廣,即使在4 ℃和8 ℃低溫層積處理下也有較高的發(fā)芽率。

脫水耐性差是頑拗性種子最重要的特征之一[4]。一些植物如蘇鐵[14]的種子在脫水過程中,由于脫水敏感性問題,導致種子發(fā)芽率隨種子含水量下降而不斷降低,直至活力喪失。隨著硅膠干燥脫水時間的延長,本研究同樣發(fā)現(xiàn)三葉木通種子逐漸失去活力,脫水至第96 h時種子活力僅有11.2%。這表明三葉木通不能忍受水分的缺失,屬于典型的脫水敏感性種子。建立種子庫是野生植物種質資源長期保存最理想的方式之一[11]。然而,對于脫水敏感性種子而言,種子含水量的降低會導致種子發(fā)芽率的下降,甚至活力完全喪失,傳統(tǒng)的低溫種子庫無法長期保存[4]。超低溫保存技術目前被認為可能是脫水敏感性種子和頑拗性種子實現(xiàn)長期保存的唯一方式,但仍處于試驗階段[4,23]。脫水敏感性與種子結構、蛋白質含量、糖類含量、膜脂過氧化、各種酶活性、脫落酸含量以及基因表達等密切相關[23],將來應加強三葉木通種子脫水敏感性機理的研究,以為三葉木通種質資源保存奠定基礎。