五味子種子種苗質量分級標準研究

賈丁丁, 尹海波, 賈 琳, 王 丹, 賈春雷, 吳 偉, 李博文

(1.遼寧中醫藥大學藥學院, 遼寧 大連 116000;2.中華人民共和國沈陽海關沈陽國際旅行衛生保健中心, 沈陽 110623)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實,習稱“北五味子”。五味子具有收斂固澀,益氣生津,補腎寧心的功效,用于治療久嗽虛喘,夢遺滑精,遺尿尿頻,久瀉不止,自汗盜汗,津傷口渴,內熱消渴,心悸失眠[1]。近年來,因野外生態變化和人為濫采,野生五味子資源不斷減少,目前,五味子藥材來源主要以栽培為主。

種子種苗的質量是保障中藥材品質的關鍵,其分級標準也是藥材規范化生產的保障[2-3]。目前,五味子種子種苗交易市場較混亂,對五味子種子種苗的定級尚不明確,造成栽培和人力資源的大量浪費。五味子種子種苗分級研究是確保其種子種苗質量、提高其藥材質量和產量的重要手段,對不同級別的種子種苗進行篩選,優選級別較高的種子種苗,促進高質量品種的選育,提高藥材安全性和有效性。本研究通過K-均值聚類等分析方法[4-6],對黑龍江、吉林、遼寧三省五味子主產地的種子種苗各指標進行分級,根據各指標分級結果優選種子種苗,促進中藥材產業健康發展[7]。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、赤霉素(北京索萊寶科技有限公司)、娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)、濃硫酸95%～98%(錦州古城化學試劑有限公司)。

VD-650型桌上式潔凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),JX-188手提式壓力蒸汽滅菌器(寧波市鎮海金鑫醫療器械有限公司),PRX-1500B智能人工氣候箱(上海坤誠科學儀器有限公司),SLY-CY液晶自動數粒機(杭州綠博儀器有限公司),游標卡尺(上海首豐精密儀器有限公司)等。

1.2 種子種苗收集

五味子種子共收集23批次,種苗共收集21批次,產地遍布遼寧、吉林和黑龍江三省,種苗均為一年生種苗,每批不少于100棵,種子每批500 g。種子種苗經遼寧中醫藥大學尹海波教授鑒定為木蘭科五味子屬植物五味子,種子種苗收集信息如表1、表2,圖1。

圖1 五味子種子(a)、種苗(b)實驗樣品

注:a為培養后第5天開始觀察結果;b～i為每天連續觀察結果,i為最終發芽結果。

注:a為染色前;b為染色后。

表1 五味子種子信息記錄

表2 五味子種苗信息記錄

1.3 測定方法

參考GB/T 3543.1～3543.7—1995《農作物種子檢驗規程》[8],每批取至少500 g種子送檢。隨機選取種子100粒,3次重復,對種子的外觀及形態特征進行測量記錄,得種子真實性信息;四分法選取每批50 g,把稱量好的種子置于超凈工作臺上,將種子與雜質分離,3次重復,取3次均值得種子凈度;每批種子1 000粒重,3次重復,取3次稱量均值得種子千粒重;稱取每批五味子種子2 g,在130 ℃條件下烘干5 h,直至2次稱重變化在0.003 g以內,即為烘干結束,3次重復,取3次測定均值得種子含水量;清水浸透五味子種子每批100粒,在30 ℃的恒溫環境中暗處理約48 h,用解剖刀沿種子胚中心線將種子縱切為二,使其胚外露,用TTC染色法染色,3次重復,取3次重復均值為種子生活力;挑選潔凈未經沙藏的五味子種子150粒,置于40～45 ℃溫水中浸泡后,用濃硫酸(95%～98%)浸泡7 min,致使種子種皮變黑。處理好后將種子用清水沖洗3遍,然后置于500×106的赤霉素中處理24 h,后在發芽床上放置50粒種子(n=3),置于25 ℃恒溫環境中,濕度50%,每天自然光照12 h進行培育。

連續觀察3 d檢查其發芽情況,無種子發芽,視為種子發芽結束。

取21批各產地種苗100棵,對苗長、莖粗、根長、根粗、芽數、側根數、單株重、每100 g種苗數等8個指標進行測定,用卷尺測量苗長(從種苗最下端到最上端的長度),游標卡尺測量莖粗(主要莖稈的直徑),利用直尺測量根長(根最頂端到最下端的長度),利用游標卡尺測量根徑(根的中部直徑),芽數為種苗各分枝存在的芽的數量,側根數為種苗主根旁現存的側根數量,單株重為利用電子天平稱取去除雜質的單株種苗的重量,每100 g種苗數為利用電子天平稱取100 g種苗,按比例計算得出的種苗數。

種子凈度/%=(供檢種子重量-雜質總重量)×100%;

發芽率/%=(發芽種子數/種子總數)×100%。

1.4 數據處理

運用SPSS26.0軟件對種子種苗指標進行統計描述與方差分析、相關性分析、K-均值聚類分析等數據處理方法[9]。根據K-均值聚類結果按照最低定級原則制定五味子種子種苗質量分級標準。

2 結果與分析

2.1 五味子種子種苗指標測定結果

五味子種子呈橢圓狀腎形,表面黃褐色,平滑,有光澤,長3.3～5.8 mm,寬2.8～4.7 mm,厚1.8～3.4 mm,種子大小均一,飽滿度好,種臍位于種子腹側凹入處,種皮硬而脆;種苗紅褐色或灰褐色,外皮具皺紋,根較細且側根較多。

對23批五味子種子5種指標進行測定并統計分析,結果見表3、表5。結果表明,各批次種子凈度、千粒重、生活力、含水量和發芽率等5個指標均具有顯著性差異,且F值大小順序依次為:發芽率、千粒重、含水量、生活力、凈度。對21批五味子種苗8種指標進行測定并進行統計描述與方差分析,結果見表4、表6。結果表明,苗長、莖粗、根長、根粗、芽數、側根數、單株重和每100 g種苗數等8個植株指標均具有顯著性差異,且F值大小順序依次為:莖粗、每100 g種苗數、苗長、側根數、單株重、根長、芽數、根粗,本實驗所用五味子種子種苗差異性較大,可以作為種苗分級依據。

表3 各產地五味子種子指標測定結果

表4 各產地五味子種苗指標

表5 各產地五味子種子信息統計描述與方差分析

表6 各產地五味子種苗信息統計描述與方差分析

2.2 種子種苗分級指標的確定

對不同產地五味子種子種苗各指標數據進行相關性分析,結果如圖4。五味子種子中千粒重與凈度呈極顯著正相關,與含水量呈顯著正相關。五味子種苗中苗長與根長、芽數、側根數、單株重呈極顯著正相關,莖粗與根粗呈極顯著正相關,根長與芽數、單株重呈極顯著正相關,芽數與側根數、單株重呈極顯著正相關,每100 g種苗數與苗長、根長、芽數、單株重呈極顯著負相關,側根數與根長、單株重呈顯著正相關。由此可得,五味子種子越重,含水量越高,其種子凈度也越高;五味子種苗苗長越高,根長越長,芽數、側根數越多,單株重越大,每100 g種苗數越少,而根粗與莖粗則與其他指標無顯著相關。結合方差分析可知,采用凈度、千粒重、含水量、生活力及發芽率等5個指標作為種子分級候選指標;采用苗長、根長、芽數、單株重、每100 g種苗數等5個指標作為種苗分級候選指標。

圖4 五味子種子(a)、種苗(b)相關性熱圖

2.3 五味子種子種苗分級標準制定

對各產地五味子種子的5個指標信息和種苗的8個指標信息進行K-均值聚類分析,分別得到4個聚類中心,結果如表7、表8。

表7 五味子種子指標聚類中心

表8 五味子種苗指標聚類中心

由方差分析可知,五味子種子各指標中,凈度、千粒重和生活力差異性不顯著,因此,選擇含水量和發芽率等2個指標作為分級標準首要指標,凈度、千粒重和生活力為分級次要指標;五味子種苗各指標中,莖粗、根粗、側根數差異性不顯著,因此,選擇苗長、根長、芽數、單株重、種苗數/100g 5個指標作為種苗分級主要指標。見表9～表12。

表9 五味子種子分級指標方差分析

表10 五味子種苗分級指標方差分析

表11 五味子種子最終聚類中心類間距離

表12 五味子種苗最終聚類中心類間距離

在五味子種子聚類中心結果中,第1類與第2、4類距離較近,與第3類距離較遠。結合種子質量指標信息,以發芽率、生活力為主要參考指標,可將種子分為3個等級,其中第1類為一級種子,第2、4類為二級種子,第3類為三級種子。種子分級標準見表13。

表13 五味子種子分級標準

在五味子種苗聚類中心結果中,第1類與第3類距離最近,與第2類次之,與第4類距離最遠。結合種苗質量指標將五味子種苗分為4級,第4類為一級苗指標,第2類為二級苗指標,第3類為三級苗指標,第1類為四級苗指標。種苗分級標準見表14。

表14 五味子種苗分級標準

根據K-均值聚類結果,23批五味子種子被分為3個等級,一級種子有3批,占全部樣品的13.04%,二級種苗16批,占全部樣品的69.57%,三級種苗4批,占全部樣品的17.39%;21批五味子種苗被分為4個等級,一級苗有3批,占全部樣品的14.3%;二級苗有6批,占全部種苗的28.6%;三級苗有10批,占全部種苗的47.6%;四級苗有2批,占全部種苗的9.5%。

3 討 論

種子種苗作為中藥材有效性和安全性的重要基礎保障,一直備受關注。種子種苗規范的制定是中藥材安全有效應用臨床的前提,目前我國種子種苗標準體系尚不完善,需要不斷更新迭代,為藥用植物資源栽培體系添磚加瓦。目前,五味子種子種苗質量良莠不齊,一方面是對五味子種子種苗質量的忽視,而另一方面是種子種苗質量標準的缺失或長時間未更新[10-11],導致栽培五味子種子種苗成活率和結果率不高,造成道地藥材五味子產量、質量、臨床療效及知名度下降等問題。

本實驗通過收集不同產地23批五味子種子和21批五味子種苗,采用相關性分析、聚類分析等方法,分別以凈度、千粒重、生活力、含水量和發芽率等5個指標和苗長、根長、芽數、單株重、每100 g種苗數等5個指標為參考確定五味子種子種苗分級標準,種子分為3個等級,其中一級種子標準為凈度≥96%,千粒重>29.08 g,含水量>6.75%,生活力>98.22%,發芽率>81.33%;二級種子標準為凈度≥96%,千粒重25.89～29.08 g,含水量6.52%～6.75%,生活力72.55%～98.22%,發芽率11%～81.33%;三級種子(不合格種子)標準為凈度<96%,千粒重<25.89 g,含水量<6.52%,生活力<72.55%,發芽率<11%。種苗分為4個等級,其中一級種苗標準為苗長>58.177 cm,根長>22.047 cm,芽數>17個,單株重>7.873 g,每100 g種苗數<15棵;二級種苗標準為苗長>34.803～≤58.177 cm,根長>15.935～≤22.047 cm,芽數>12～≤17個,單株重>3.055～≤7.873 g,每100 g種苗數>15～≤31棵;三級種苗標準為苗長26.453～34.803 cm,根長14.715～15.935 cm,芽數10～12個,單株重1.442～3.055 g,每100 g種苗數 >31～≤70棵;四級種苗(不合格種苗)標準為苗長<26.453 cm,根長<14.715 cm,芽數<10個,單株重<1.442 g,每100 g種苗數>70棵。如一批五味子種子種苗中當不合格數≤5%時,判該批合格,當不合格數 > 5%時,判該批不合格,則劃為下一級。