雌穗膨大多行數玉米突變遺傳性狀鑒定評價

楊 萌, 文仁來, 田樹云, 黃愛花, 鄒成林, 莫潤秀,翟瑞寧, 黃開健, 韋新興, 譚業(yè)琴, 何雪銀

(1.廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院玉米研究所, 南寧 530007;2.廣西農業(yè)職業(yè)技術大學, 南寧 530007)

雌穗是玉米產量的直接載體,穗長、穗粗、穗重、穗行數、行粒數和軸粗、軸重等是重要的產量組成部分[1]。在相同種植密度下,玉米單位面積產量由雌穗數和單穗籽粒產量決定,而單穗籽粒產量由每穗粒數和百粒重決定,每穗粒數由穗行數和行粒數決定[2]。通常情況下雌穗體積越大,籽粒行數越多,單株產量越大。但熱帶、亞熱帶玉米材料相較于溫帶玉米材料雌穗偏小、穗行數偏少,因此鑒定、分析從廣西亞熱帶玉米群體改良過程中收集的雌穗膨大多行數玉米材料的表型遺傳特性,對進一步解析玉米雌穗行數的內在決定因素及其遺傳規(guī)律,定向改良廣西玉米育種群體的穗行數性狀具有重要意義。

玉米生殖生長開始后,莖頂端分生組織轉變成花序分生組織(Inflorescence meristem,IM),IM形成排列整齊的成對小穗分生組織(Spikelet pair meristem,SPM),1個SPM產生2個小穗分生組織(Spikelet meristem,SM),每個SM再產生2個小花分生組織(Flower meristem,FM)[3],共經歷生長錐伸長、小穗分化、小花分化和性器官形成4個時期成為雌穗[4]。整個過程由多個基因共同調控,主效基因較少,微效QTL較多[5-6],包括直接調控花序分生組織生長發(fā)育的基因[7-12]和相關轉錄因子[13-16]、植物激素[17-19]及micro RNA[20-21]等調節(jié)因子。其中,雌穗行數(即在垂直穗軸方向上由SPM最終發(fā)育成的FM數目)是玉米產量高低的決定因素之一[22-23]。復合區(qū)間作圖和玉米SNP10/50芯片等技術是挖掘基因位點的常用方法,多年來研究人員利用該方法在不同染色體上鑒定出多個穗行數相關QTL[24-26]。同時利用多份不同的自然群體材料進行表型-基因型關聯分析,也是挖掘穗行數相關位點的有效方法。Liu等[27]在5個種植環(huán)境下對513份自然群體的玉米材料的雌穗性狀進行最佳線性無偏預測分析(Best linear unbiased prediction,BLUP),在10條染色體上檢測到17個穗行數QTL,其中24個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)變異可解釋大于5%的表型變異。Xiao等[1]利用包含14個親本遺傳背景的10個重組自交系(Recombined inbred lines,RIL)復合群體,獲得控制4個穗部性狀的107個QTL,其中控制穗行數的QTL多為加性或部分顯性效應。Chen等[28]利用序列基因分型(Genotyping by sequence,GBS)測序分析方法繪制高密度染色體圖譜得到一個重要穗行數位點qKRN5,但基因的定位區(qū)間長達4.8 Mb,其他多個穗部性狀QTL最小定位區(qū)間也大于700 K。因此,精細定位并克隆更多穗行數相關QTL進行玉米雌穗性狀的分子改良仍然任重道遠。在調控雌穗軸發(fā)育的單基因突變中,研究較為深入的是FEA2基因,該基因編碼一個受體蛋白,通過CLAVATA基因信號通路調節(jié)分生組織發(fā)育,其突變體雌穗分生組織過度增殖導致雌穗過度膨大[29]。Peter等[10]進一步研究發(fā)現,一份FEA2基因的弱等位突變型,在引起穗軸扁化和穗行數增加的同時不導致果穗過度變形,比野生型植株增產13%。Byoung等[30]報道了與FEA2表型相似的突變體FEA3,其雌穗頂端出現多個生長點,穗軸扁化,研究表明,FEA3通過響應CLAVATA3/CLE在器官原基中的表達進而調控雌穗分生組織增殖,其弱等位突變型同樣能提高雜交玉米產量。

本研究對廣西亞熱帶玉米群體進行改良的過程中收集到一份雌穗膨大多行數材料,但對于該材料的種質背景、變異特征、細胞組織特征以及受單一基因還是多個QTL位點調控等方面并不清楚,難以開發(fā)利用,因此將其與穗軸較細、穗行數12行的優(yōu)良育種材料桂18421雜交再自交構建遺傳分析群體,進行性狀鑒定和遺傳背景分析,以明確該材料表型性狀的遺傳分離規(guī)律,并利用40對SSR標記和23份廣西育種中使用的骨干自交系,對該多行數玉米材料自交過程中保留的2個姐妹系進行遺傳背景分析,為利用多行玉米材料進行玉米群體改良、新品種選育、QTL挖掘及分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗材料為廣西基礎育種群體(7239與CML285雜交建立的選系群體,7239為早年間玉米品種隆玉2號的母本之一,CML285來自國際玉米小麥改良中心,該群體曾選育出廣西優(yōu)良雜交品種桂單0810的母本桂39722)和對新材料培育中發(fā)現的雌穗膨大變異植株(經多代自交純化形成的穩(wěn)定變異材料),該變異株穗行數22行,初步命名為fcb(flat corncob),在自交純化過程中保留了2個姐妹系,分別命名為fcb1和fcb2(圖1B、C),其雌穗外形與已報道的FEA2基因弱等位型突變體具有一定相似性(圖1D～G)[10]。試驗對照材料為穗行數12行的廣西自選材料桂18421(圖1A)。

注:A為對照桂18421,B～C為fcb,D～G為FEA2突變體及等位突變表型。

1.2 方 法

1.2.1 田間種植

將fcb1(P1)與桂18421(P2)雜交,并連續(xù)自交2代,構建F2∶3群體,進行農藝表型、細胞形態(tài)和遺傳分離分析,P1、P2、F1、F2和F3各世代分別調查10株、10株、10株、300株和3 000株,田間種植管理與大田農業(yè)生產相同。與fcb兩個姐妹系(fcb1和fcb2)以及其他23份材料一起進行遺傳背景分析(表1)。

表1 用于遺傳背景分析的玉米材料名稱及其來源

1.2.2農藝性狀測定與分析

進行表型測量的P1、P2、F1和F2各代植株全部自交授粉,待果穗收獲曬干后考察穗粗、軸粗、穗行數以及穗軸是否扁化,穗粗和軸粗分別用游標卡尺測量橫切面,扁穗橫切面表現出橢圓形,分別測量其(穗、軸)長、短直徑,并以平均值表示該果穗的穗粗或軸粗,以長軸/短軸表示穗或軸的扁化程度,比值等于1表示未發(fā)生扁化。P1、P2和F1的各項表型數據分別為10株的平均值,F2∶3家系的穗行數測定為F2單株結合相應F3后代數據,其300份F2雌穗分別單穗考種,300行F3每行測定10枚雌穗取平均值與對應上代F2進行比較,以增加F2表型數據的準確性。

1.2.3細胞組織觀察

在授粉后5～10 d,取發(fā)育中的幼嫩雌穗,在雌穗中上部垂直穗軸方向橫切取樣,制作石蠟切片和番紅固綠染色,光學顯微鏡觀察細胞組織結構形態(tài),主要步驟如下:

材料脫水:將新鮮雌穗組織用FAA固定液固定24 h,然后取出放于脫水盒內,再放進脫水機內依次用不同濃度梯度乙醇進行脫水:75%乙醇4 h,85%乙醇2 h,90%乙醇2 h,95%乙醇、1 h,無水乙醇2次,各30 min,醇苯1次10 min,二甲苯2次,各10 min。

石蠟包埋:65 ℃融化石蠟1 h,將浸好蠟的細胞組織置于包埋機內并貼上對應的標簽,再置于-20 ℃凍臺冷卻,蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。

切片:將修整好的石蠟塊置于石蠟切片機切片(厚4 μm),切片漂浮于攤片機40 ℃溫水上將組織展平,載玻片將組織撈起,60 ℃烘箱內烤片。

脫蠟:依次將切片放入二甲苯脫蠟2次,各20 min,無水乙醇脫蠟2次,各5 min,75%乙醇1次5 min,蒸餾水清洗。

染色:將切片放入植物番紅染色液中染色2 h,自來水清洗去除多余染料,將切片依次放入50%,70%和80%梯度乙醇中各5 s,之后將切片放入植物固綠染色液中染色約15 s,無水乙醇脫水3次。

封片觀察:將切片置于二甲苯中透明5 min,中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢,進行圖像采集。

1.2.4遺傳背景分析

采用CTAB小量提取法制備玉米基因組總DNA[31],從玉米基因組數據庫(www.maizegdb.org)中查找合成SSR標記,選擇其中帶型清晰、分布均勻,多態(tài)性明顯的40對(表2),采用10 μL PCR體系擴增,經7%聚丙烯酰胺凝膠電泳,0.1%硝酸銀染色顯影,以Excel2016軟件記錄帶型統(tǒng)計結果,將相同遷移率位置上有條帶的記1,無條帶的記0。

表2 40對SSR標記

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數據采用Excel2016軟件記錄測量數據,利用SPASS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析;采用NTsys2.10e軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 多穗行玉米雌穗表型性狀分析

雌穗膨大主要表現為穗行數增加、果穗變粗、穗軸變粗、穗扁化和軸扁化5種特征,這些特征在F2代發(fā)生不同程度的分離。如圖2所示,在F2代分離群體中,F2代穗行數具有12,14,16,18,20,22行共6種分離表型,相關性分析結果(表3)顯示,雌穗行數與穗粗、軸粗及穗扁化度均呈極顯著性相關,與軸扁化度不相關,說明該變異材料雌穗膨大性狀的不同特征可能受多個數量性狀位點(QTL)分別控制,且不同位點之間有累加或協同效應。結果(表4)表明,不同雌穗行數對穗粗有極顯著性影響,對軸粗存在顯著性影響,同時由穗粗、軸粗與行數的相關性度量分析結果(表5)可知,隨著雌穗行數的增多,穗粗增加的正向效應大于軸粗,說明其QTL增加穗行數帶來的增產潛力大于其負面影響。在F2分離群體中,6種穗行數的玉米分離比為1∶9.6∶12.6∶7.9∶1.8∶0.6,呈連續(xù)正態(tài)分布,說明有2個QTL調控影響穗行數性狀,基因間具有累加效應。

圖2 F2群體不同穗行數頻率分布情況

表3 F2群體各表型性狀指標的相關分析結果

表4 F2群體不同行數對穗粗與軸粗的影響

表5 F2群體穗粗、軸粗與行數的相關度量分析結果

2.2 多穗行玉米雌穗膨大的細胞學成因

通過對幼嫩雌穗做橫截面石蠟切片,經番紅固綠染色后進行光學顯微觀察,發(fā)現穗軸變異特征表現出分生組織體積變大,髓腔及其外圍維管束數目和層數變多,在正常維管束層外圍和小穗著生部位出現較多散亂分布的形態(tài)完整度不一的維管組織細胞,如圖3所示,該特征與FEA2弱等位突變型植株的雌穗表型變化較類似[15],主要為花序分生組織細胞過度分裂分化,穗軸各心皮在生長過程中過度發(fā)育相互擠壓,導致穗軸變形。

圖3 fcb雌穗橫切面小花形態(tài)

2.3 多穗行玉米的雜種優(yōu)勢群劃分

利用40對SSR標記在25份樣品中共檢測出162個電泳帶型清晰穩(wěn)定、多態(tài)性良好的等位基因,每對標記可檢測3～5個,平均4.1個。以遺傳相似度系數0.77為標準,可將25份玉米材料劃分為3個雜種優(yōu)勢群,少量遺傳距離較遠的種質材料無法有效分群。

第Ⅰ類群包含6份材料,是以泰國Swan(late)C4群體為基礎選育的熱帶、亞熱帶玉米材料及其衍生種質,包含品種桂單0810的父本桂兆18421。第Ⅱ類群包含10份材料,以遺傳相似度系數0.79為標準,可進一步分為2個亞群,第Ⅱ-1亞群以桂39722為核心,包含掖478,具有一定亞熱帶種質血緣的改良瑞德群體;第Ⅱ-2亞群包括4份廣西本土自交系材料。第Ⅲ類群包含3份材料,均為廣西本土自交系。此外有3份種質材料(先21A、LH196、W8555)與其他材料遺傳距離較遠,未能有效分群。本研究中使用的玉米材料齊319、丹340和黃早4為國內玉米雜種優(yōu)勢群常用測驗種,聚類分析結果表明,本研究未包含與其背景較為相近的種質材料。由此可知,fcb與目前廣西本土主栽的桂單0810、母本桂39722、廣西國審品種桂單203、母本桂F0857、玉米新組合689、父本GML2020及掖478等劃歸為一類,屬于具有溫-熱種質背景的改良瑞德群體,而其自交過程中保留的兩個姐妹系在40對SSR標記中未檢測到差異。

3 結論與討論

3.1 玉米雌穗膨大材料為一份新的基因變異

在已公開報道的參與調控雌穗發(fā)育的相關基因中,2013年報道的玉米基因FEA2發(fā)生隱性突變后可導致雌穗的膨大變形,最終引起穗行數增加而促進增產[29],本研究材料與2016年報道的FEA2弱等位突變表型較相似,但又具有明顯不同的特點:FEA2基因調控雌穗分生組織發(fā)育,基因突變后表型變化比較劇烈的等位型會出現分叉和不規(guī)則的雌穗,弱等位突變型會導致雌穗扁化、穗軸變粗、尖端月牙形、穗行數增加和穗行不整齊、穗中部籽粒不飽滿等表型,且這些變化在后代不會發(fā)生分離[10]。本研究材料具有的此類特征會在F2代等后代群體不同單株間發(fā)生一定分離,表明其雌穗體積增大、變化及多行數等特征可能由多個QTL控制,這點與FEA2基因的突變體不同。2022年報道的控制玉米穗行數的KRN2基因來自具有野生玉米背景穗行數6行的特異玉米材料,其野生等位型負調控玉米雌穗行數,利用基因編輯技術創(chuàng)制的KRN2基因功能喪失材料可提高約10%的玉米產量[32]?？芍?已克隆的FEA2和KRN2基因介導的性狀變化與本研究材料fcb明顯不同,因此fcb可能為新的未知基因位點變異,后期進一步將fcb增加穗行數的基因位點單獨分離進行精細定位和基因克隆,具有較高的基礎理論研究和育種應用價值。

3.2 雌穗行數與玉米產量密切相關

本研究根據廣西種子管理局網站(http://www.gxseed.com.cn)公布的信息,對2005年、2014—2021年年度所有玉米品種的相關數據進行了歸納統(tǒng)計,顯示最近十多年間審定廣西玉米品種的穗行數平均增幅約7%,穗粗平均增幅約6%,千粒重平均增幅約10%,而穗長降幅約5%,行粒數降幅約9.5%,穗粒重和單位株數基本保持不變,表明玉米籽粒的容重和穗行數是近年來廣西玉米品種的重要增產點,與鄒成林等[33]和梁曉玲等[34]的研究結果一致。一般情況下,穗行數增加易伴隨穗軸變粗和籽粒變小、千粒重降低等不利性狀,統(tǒng)計結果表明,廣西玉米品種的選育在提升穗行數的同時較好地將穗粗增幅控制在較低水平,同時提高了千粒重,而行粒數略微降低源自籽粒厚度增加,實際有助于增加籽粒品質和千粒重。

3.3 調控穗行數的QTL的開發(fā)利用

本研究中,利用40對SSR標記進行的遺傳背景分析,將fcb劃歸為屬于具有溫-熱混合血緣背景的改良瑞德群體。因此,一方面可以通過常規(guī)雜交育種的方式,利用fcb對同雜種優(yōu)勢群的優(yōu)良材料及衍生品系進行穗行數性狀改良,或者與其他雜種優(yōu)勢群的材料進行雜交組配,選育新品種[35-36];另一方面,利用分子生物學技術挖掘其與穗行數相關的基因位點,通過分子標記輔助進行單基因導入,實現對穗行數的定向改良,可以克服雜種優(yōu)勢群的限制。此外,可以進一步將fcb與其他控制雌穗發(fā)育的優(yōu)良基因,例如玉米基因ZmKL9(能顯著提高玉米粒重、穗長和穗粒數[37])、ZmEXPB15基因(調控玉米籽粒大小和粒重[38])等進行基因聚合,以更有效地在增加穗行數的同時避免穗軸變粗、容重降低、籽粒變小、千粒重減小、雌穗變短以及配合力降低等負面影響[39]。因此,在后續(xù)研究中,可利用篩選出的行數多和行數少的F2∶3家系,分別提取F2葉片DNA,構建兩個極端DNA混池,在全基因組利用分子標記進行基因初步定位,并利用高世代回交群體進一步精細定位,開發(fā)與穗行數相連鎖的分子標記。

綜上所述,從廣西玉米基礎群體中收集的雌穗膨大多行數玉米材料為一份新的未知基因突變材料,具有溫-熱混合血緣背景,其多穗行性狀符合廣西玉米生產需求,可用于群體性狀改良或利用溫-熱×熱雜種優(yōu)勢配對模式對其進行雜交組配,選育新品種。同時,可進一步挖掘其控制穗行數的QTL,進行分子標記輔助育種及解析玉米雌穗發(fā)育的分子遺傳機理。