利用線粒體序列比較分析梭鱸鴨綠江和烏倫古湖群體的遺傳結構

孫志鵬，魯翠云，那榮濱，鄭先虎

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術與遺傳育種重點實驗室，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

梭鱸（Sander lucioperca）體肥肉厚、營養(yǎng)豐富、肉質細嫩、味道鮮美，素有“淡水魚王”之稱，俗稱十道黑、牙魚，屬鱸形目（Perciformes）、鱸科（Percidae）、梭鱸屬。梭鱸肌肉粗蛋白水平（20.99%）和總氨基酸含量顯著高于加州鱸（Micropterus salmoides）（18.63%）和鱖（Siniperca chuatsi）（18.90%）[1-4]，粗脂肪水平（0.63%）顯著低于加州鱸（4.58%）和鱖（2.56%），是具有廣闊發(fā)展前景的淡水養(yǎng)殖對象。梭鱸在我國主要分布于新疆額爾齊斯河水系、伊犁河水系和黑龍江水系[5]。1992 年，新疆福海縣水產(chǎn)技術推廣站成功地人工繁殖出梭鱸，隨后推廣到全國十幾個省區(qū)[6]。目前，許多天然水體，如黑龍江、興凱湖和烏蘇里江在漁業(yè)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)了梭鱸[5,7,8]。本研究團隊在鴨綠江發(fā)現(xiàn)有梭鱸群體存在，且具有較大的資源量，其來源不詳。烏倫古湖作為最早開展梭鱸繁殖的水體，是我國梭鱸資源的主要產(chǎn)地和供給地。本研究比較分析了梭鱸鴨綠江群體與烏倫古湖群體的遺傳差異。

線粒體DNA（Mitochondria DNA,mtDNA）具有結構簡單、突變速度快、單倍型隨機缺失、較穩(wěn)定的母系遺傳等特點，已被廣泛應用于研究群體遺傳結構和物種進化等[9，10]。線粒體細胞色素b（Mitochondria cytochrome b，Cyt b）基因和線粒體DNA 控制區(qū)（又稱D-環(huán)區(qū)，control region displacement loop，DLoop）是常用的線粒體標記基因[11-13]。Cyt b 基因進化速度適中，其變異主要為轉換和顛換，能較好地顯示不同科、屬、種間的進化關系，常用于構建物種系統(tǒng)發(fā)育關系[14,15]。D-loop 區(qū)處于非編碼區(qū)，構特殊，富含A-T 堿基，是線粒體基因組中進化速度最快的區(qū)域和研究魚類近緣種間進化關系和種群多樣性的重要分子標記[16-18]。目前國內(nèi)有關梭鱸主要分布群體的遺傳多樣性研究較少，本研究結合這2種標記的特點，比較分析了資源記錄最早的烏倫古湖梭鱸群體及本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)的鴨綠江梭鱸群體的遺傳結構，有助于了解其資源狀況，為梭鱸種質資源保護及繁育利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

梭鱸樣品分別于2021 年6—8 月取自新疆烏倫古湖（XJ，48 尾）和鴨綠江丹東段（YL，62 尾），剪取部分鰭條用無水乙醇固定后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 提取

參照基因組提取試劑盒（天根生物）使用說明，從梭鱸鰭條組織中提取基因組DNA，用NanoDropTM8000 分光光度計檢測所提取DNA 的濃度及純度，稀釋至50 ng/μL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴增與測序

使用引物L14724 和H15149 擴增梭鱸Cyt b基因部分序列[19]。根據(jù)梭鱸線粒體基因組全序列（GenBank 收錄號：KP125333）[20]設計D-loop 引物、S-Dloop1F 和S-Dloop1R。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成（表1）。Cyt b 基因序列和D-loop控制區(qū)的PCR 反應體系均為25 μL，其中模板DNA 2 μL（50 ng/μL）、混合PCR 緩沖液buffer 18 μL（10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP）、上下游引物（10 μm/L）各0.6 μL、Taq DNA 聚合酶1.5 U，其余體積用去離子水補充。擴增反應在ABI 9700 型PCR 儀上完成，反應程序為:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度復性45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR 反應結束后，取少量產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測合格后，由上海生工生物工程技術服務有限公司純化后正向測序。

表1 擴增梭鱸Cyt b 和D-loop 區(qū)序列所使用的引物Tab.1 Primers used to amplify Cyt b gene and D-loop sequences of mtDNA in pikeperch Sander lucioperca

1.4 序列數(shù)據(jù)分析

測序后，將序列輸入Clustal X 軟件[21]進行序列的對位排列，加以人工校對，截取相同長度的序列用于群體遺傳分析。用DnaSP v 5 軟件[22]統(tǒng)計變異位點類型和數(shù)目及簡約信息位點數(shù)，計算單倍型數(shù)、單倍型多樣性（haplotype diversity,Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π），識別每個群體的單倍型組成;進行Tajima's D 和Fu's Fs 的中性檢驗。用MEGA 7.0 軟件[23]分析序列的堿基組成和轉換/顛換值，用Kimura 2-Parameters 方法計算群體內(nèi)和群體間的遺傳距離，以梭鱸（KP125333）作為參考序列，以加拿大梭鱸（S.canadensis）（MH301082）作為外群繪制基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）[24]的單倍型發(fā)生關系圖，采用Bootstrap（1 000）檢驗分子系統(tǒng)樹各分支的置信度。用PopART 軟件基于TCS 算法，繪制單倍型網(wǎng)絡圖。用Arlequin 3.11 軟件[25]中的分子方差分析（AMOVA）計算群體間及群體內(nèi)的遺傳變異組成，以及群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst）。

2 結果與分析

2.1 梭鱸Cyt b 基因序列和D-loop 區(qū)序列特征

將所測得的序列與梭鱸參考線粒體基因組序列（KP125333）進行比對，去除引物序列及低質量序列，截取425 bp 的Cyt b 基因序列和479 bp 的Dloop 區(qū)序列用于分析群體遺傳多樣性。Cyt b 基因共檢測到保守位點423 個，變異位點2 個，其中單變異位點1 個，簡約信息位點1 個，定義了3 種單倍型（HapA～HapC，表2）。測得的序列中A、T、C、G 的堿基組成分別為26.55%、30.82%、27.30% 和15.33%，其中A+T 含量（57.37%）高于C+G 含量（42.63%），堿基明顯偏向A+T，轉換/ 顛換值R=14.625。D-loop 區(qū)共檢測到保守位點453 個，變異位點26 個，其中單變異位點19 個，簡約信息位點7 個，定義了17 種單倍型（Hap1～Hap17，表3）。測得的序列中A、T、C、G 的堿基組成分別為32.40%、34.24%、18.38%和14.98%，其中A+T 含量（66.64%）明顯高于C+G 含量（33.36%），堿基組成具有明顯的偏倚性，轉換/顛換值R=0.988。

表2 梭鱸群體Cyt b 基因序列變異位點Tab.2 Variable loci of Cyt b gene sequence in Sander lucioperca

表3 梭鱸群體D-loop 基因序列變異位點Tab.3 Variable loci of D-loop sequence in pikeperch Sander lucioperca

2.2 梭鱸群體單倍型分析

在110 個梭鱸Cyt b 基因序列中，檢測到3 個單倍型。單倍型HapA 為2 群體共享單倍型，出現(xiàn)頻次最高，分布于92 個樣本中，占總數(shù)83.64%；其次為HapC（17 個）占總數(shù)15.45%，為XJ 特有單倍型；HapB 為YL 特有單倍型，只有1 個。NJ 聚類圖顯示，HapA、HapB 與梭鱸參考序列KP125333 聚為一支，再與HapC 聚為一大支，加拿大梭鱸作為外群獨立為一支（圖1）。單倍型網(wǎng)絡圖顯示，HapB 和HapC以HapA 為中心，各有1 個變異位點（圖2）。

圖1 梭鱸群體基于Cyt b 基因序列的3 個單倍型分布及NJ 聚類圖Fig.1 Distribution of three haplotypes and NJ dendrogram based on Cyt b gene of mtDNA in Sander lucioperca

圖2 梭鱸基于Cyt b 基因的單倍型網(wǎng)絡圖Fig.2 Haplotypes network in pikeperch Sander lucioperca based on Cyt b gene of mtDNA

87 個梭鱸D-loop 序列中檢測到17 個單倍型。單倍型Hap1 數(shù)量最多（65 個），占總數(shù)74.71%，為2 群體共享單倍型;其他單倍型均為1～3 個不等，Hap13～17 為XJ 特有單倍型，剩余Hap2～12 為YL特有單倍型。NJ 聚類圖顯示，大多數(shù)單倍型（Hap1、Hap10、Hap3、Hap7、Hap6、Hap15、Hap4、Hap8、Hap2、Hap9、Hap11、Hap12 和Hap5）與梭鱸參考序列KP1 25333 聚為一支，再與Hap14、Hap13 和Hap16 聚為一大支，Hap17 獨立為一支，加拿大梭鱸作為外群獨立為一支（圖3）。單倍型網(wǎng)絡圖以Hap1 為中心呈現(xiàn)放射狀結構，Hap3、Hap4、Hap5、Hap11、Hap15、Hap17 與Hap1 相比只變異1 個位點，其他單倍型變異位點較多，YL 群體與XJ 群體除Hap1 共享外，單倍型分隔明顯（圖4）。

圖3 梭鱸群體基于D-loop 序列的17 個單倍型分布及NJ聚類圖Fig.3 Distribution and NJ dendrogram of 17 haplotypes in pikeperch Sander lucioperca base d on D-loop sequence of mtDNA

圖4 梭鱸基于D-loop 序列的單倍型網(wǎng)絡圖Fig.4 Haplotypes network in Sander lucioperca based on D-loop sequence of mtDNA

2.3 梭鱸群體遺傳多樣性

2 群體Cyt b 基因序列的單倍型數(shù)（nh）均為2個，總體單倍型多樣性（Hd）為0.279±0.049，核苷酸多樣性（π）為0.000 66±0.000 12，YL 的單倍型多樣性和核苷酸多樣性明顯低于XJ。Tajima's D 和Fu’s Fs 檢驗結果都顯示，2 群體差異均不顯著，符合中性突變，說明群體保持穩(wěn)定（表4）。

表4 梭鱸群體基于Cyt b 基因和D-loop 序列的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity estimates in pikeperch Sander lucioperca based on Cyt b gene and D-loop sequence of mtDNA

2 群體D-loop 序列的單倍型數(shù)（nh）為6～12個，總體單倍型多樣性（Hd）為0.442±0.068，核苷酸多樣性（π）為0.002 25±0.000 52，YL 的單倍型多樣性和核苷酸多樣性略高于XJ。Tajima's D 中性檢驗及Fu’s Fs 檢驗結果顯示，YL 差異不顯著，符合中性突變，群體穩(wěn)定；而XJ 差異顯著且均為負值，表明群體曾經(jīng)歷過快速擴張；2 群體D-loop 序列總體極顯著偏離中性突變（表4）。

2.4 梭鱸群體間遺傳分化與遺傳距離

梭鱸群體Cyt b 基因的35.44%的遺傳變異來自群體間，遺傳分化系數(shù)（FST）為0.354 38，表明群體遺傳分化程度極大（FST＞0.25），達到顯著水平。梭鱸群體D-loop 序列的群體間遺傳分化系數(shù)（FST）為0.025 82，分化程度很大，群體內(nèi)遺傳變異（97.42%）遠大于群體間（2.58%），遺傳分化也主要來自群體內(nèi)，與Cyt b 結果一致（表5）。Cyt b 基因的群體間遺傳分化程度稍大于D-loop 序列。

表5 基于線粒體Cyt b 基因和D-loop 序列的AMOVA 分析結果Tab.5 The result of AMOVA based on Cyt b gene and D-loop sequence of mtDNA

利用Cyt b 基因序列和Kimura 2-Parameters 方法計算的2 群體之間的遺傳距離顯示，YL 與XJ 的遺傳距離為0.000 873，YL 和XJ 群體內(nèi)遺傳距離分別為0.000 076 和0.001 102；利用D-loop 序列分析顯示，2 群體間遺傳距離為0.002 269，YL 和XJ 群體內(nèi)遺傳距離分別為0.002 422 和0.001 919（表5）。D-loop 序列分析2 群體間遺傳距離大于Cyt b基因序列。鴨綠江群體內(nèi)遺傳距離大于群體間，也提示這個群體可能是一個混合來源的群體。

3 討論

本研究運用序列測定技術，分析鴨綠江和烏倫古湖2 個梭鱸群體的Cyt b 基因和D-loop 區(qū)序列特征，發(fā)現(xiàn)梭鱸這兩個基因都有高（A+T）含量、低（G+C）值含量的特點，與杜景豪等[26]對日本囊蝦（Penaeus japonicus）線粒體Cyt b 和D-loop 基因序列的研究結果相符，也與孔杰等[27]對施氏鱘（Acipenser schrencki）和西伯利亞鱘（Acipenser baerii）線粒體Cyt b 和D-loop 基因序列的研究結果相符。Dibattista 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動物線粒體都具有高A+T值低G+C值特點。胡玉婷及王楨璐等[29,30]發(fā)現(xiàn)堿基中A+T 的含量越高，線粒體DNA 的進化優(yōu)勢越明顯。本研究中，Cyt b 基因和D-loop 區(qū)序列的鴨綠江梭鱸和烏倫古湖梭鱸A+T 含量分別為57.41%、57.30%（Cyt b）和66.69%、66.60%（D-loop），均明顯高于G+C 含量，鴨綠江與烏倫古湖相比，堿基含量沒有明顯差異，表明鴨綠江與烏倫古湖梭鱸群體進化較為同步。本研究中2 群體D-loop 區(qū)的A+T 含量均明顯大于Cyt b 的A+T 含量，表明堿基組成有偏倚性，說明本研究梭鱸群體的D-loop 比Cyt b 基因在進化中更具優(yōu)勢。吳靜等[31]發(fā)現(xiàn)。生物體進化過程中顛換是不斷積累的，因此轉換/顛換的比值逐漸減小，一般認為當比值小于2 時，基因序列突變已經(jīng)達到飽和狀態(tài)。本研究結果顯示，鴨綠江梭鱸D-loop 的轉換/顛換比值為0.504，表示其突變已經(jīng)達到飽和。

遺傳多樣性可有效反應生物適應生存能力，遺傳多樣性越高，該生物體的遺傳育種潛力越豐富[32]。單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（π）是衡量一個群體mtDNA 遺傳多樣性的重要指標，核苷酸多樣性能體現(xiàn)各種mtDNA 單倍型在群體中所占的比例，能更準確地表現(xiàn)一個群體的多態(tài)程度，π 值越高表明遺傳多樣性越高。Ichikawa-Seki 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，當一個群體核苷酸多樣性指數(shù)在0.001 5～0.004 7時，該群體的遺傳多樣性較低。本研究發(fā)現(xiàn)，鴨綠江及烏倫古湖梭鱸群體遺傳多樣性較低。Grant 等[34]根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性之間的關系將群體的擴張事件分為4 種類型：第一類為低單倍型多樣性和低核苷酸多樣性（Hd<0.5，π<0.5%）；第二類為高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性（Hd＞0.5，π<0.5%）；第三類為低單倍體多樣性和高核酸多樣性；第四類為高單倍體多樣性和高核酸多樣性。鴨綠江及烏倫古湖梭鱸群體遺傳多樣性類型應屬于第一類型。此種類型表明群體最近發(fā)生了瓶頸效應或由單一、少數(shù)系群發(fā)生了奠基者效應[35]。梭鱸鴨綠江群體及烏倫古湖群體均受到奠基者效應的影響，群體遺傳多樣性較低。

本研究結果顯示，Cyt b 基因的種群間變異率35.44%明顯低于種群內(nèi)變異率64.56%，D-loop 基因種群內(nèi)變異率97.42%也明顯高于種群間變異率2.58%。表明變異主要來自于種群內(nèi)，可能是由不同水系不同批次引入梭鱸造成。一般通過Tajima's D檢驗及Fu’s Fs 檢驗來檢測種或種群內(nèi)部的自然選擇作用。本研究基于D-loop 基因序列Tajima's D 檢測及Fu’s Fs 檢驗結果均顯示，烏倫古湖群體為負值且顯著偏離中性檢驗（P＜0.01），說明該群體在近期歷史階段出現(xiàn)過種群快速擴張事件。Heather 等[36]根據(jù)群體間遺傳分化系數(shù)（FST）大小劃定了群體的分化程度（高度分化，F(xiàn)ST＞0.25；中度分化，0.05＜FST≤0.25；低度分化，0＜FST≤0.05），作為群體遺傳分化標準被廣泛認可。本研究中，Cyt b 基因的群體間遺傳分化系數(shù)（FST）為0.35438，大于0.25，表明兩個梭鱸群體分化程度較高。魯翠云等[37]利用COI 基因分析了國內(nèi)外8 個群體梭鱸的遺傳結構，在FST判定方面發(fā)現(xiàn)國內(nèi)群體除黑河群體外，XJ 群體和YL 群體并無明顯分化，主要是由于參照不同導致，在與國外群體相對比時，F(xiàn)ST相對減小。

本研究結果提示，鴨綠江群體部分可能來源于逃逸、放生或養(yǎng)殖棄養(yǎng)等，不完全來源于烏倫古湖群體，且鴨綠江及烏倫古湖梭鱸群體分化程度較高，遺傳多樣性較低。本研究所得到的梭鱸種群遺傳結構特征對于其人工繁育及遺傳多樣性的監(jiān)測具有重要意義。