水生動物致病菌sRNA 研究進展

王荃生，劉蘇，王朵，胡永華

（1.河北農業大學海洋學院，河北 秦皇島 066000；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 ?？?571101）

細菌中的sRNA（small RNA）是一類長度在40～500 nt（Nucleotide）的非編碼的起調控作用的小分子RNA，主要通過與靶mRNA 或靶蛋白質結合發揮生物學功能，是基因表達的重要調控因子[1]。研究表明，大部分sRNA 需要依靠分子伴侶蛋白才能有效地發揮其調控作用[2]。病原菌在與其宿主長時間的互作過程中，產生了能感知宿主信號變化的調節基因。當宿主環境改變且釋放相關信號因子時，相應的病原菌sRNA 會即刻調控相關基因的表達，以抵抗宿主環境因子的脅迫。目前已發現多種在細菌毒力調控中起重要作用的sRNA。這些sRNA 通常只需要經轉錄過程就能發揮作用，大大減少細胞代謝的各種消耗，使其快速適應新的環境[3]。在與人類密切相關的致病菌中，如大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和沙門氏菌（Salmonella）等，sRNA 的研究較為深入，其研究結果極大促進了病原菌致病機制的闡析[4-9]。

相比于人類致病菌，水生動物致病菌所處環境特殊性，導致包括sRNA 在內的許多基因功能出現明顯差異。在溶藻弧菌中，sRNA srvg23535 參與該病原菌對碳源和氮源的利用、對滲透壓的耐受性和pH 脅迫反應[10]；sRNA srvg17985 參與該病原菌對Gly-Glu 碳源的利用、對NaCl 的耐受性、對尿素的耐受性和堿脅迫反應[11]；sRNA Qrr 參與該病原菌的生長能力、運動性、形成生物膜能力、細胞外多糖含量、產生絲氨酸蛋白酶的能力和對宿主的侵染能力等[12]。在殺魚愛德華氏菌中，sR082 與該病原菌抵御酸脅迫相關，sR012 與氧化壓力密切相關，而EsR240 與酸脅迫和氧化壓力都有關相關[13-15]。在無乳鏈球菌中，SQ18、SQ485 和SQ893 三個sRNA 調控相鄰基因的表達，并且SQ18 asRNA 通過反義機制下調Sip 基因的表達[16]。目前，水生動物致病菌sRNA 的研究起步較晚，其功能和機制仍亟待闡明。

本文概述了sRNA 的調控機制及其在水生動物致病菌如溶藻弧菌、殺魚愛德華氏菌、無乳鏈球菌、魯氏耶爾森氏菌、維氏氣單胞菌、副溶血性弧菌中的研究進展。

1 sRNA 調控基因表達的機制

隨著對sRNA 調控細菌基因表達機制研究的深入，人們對sRNA 在細菌生命活動中扮演的角色有了更深刻、更多元化的認識。以下是目前比較清晰的sRNA 調控機制。

1.1 sRNA 與靶mRNA 堿基配對調控目的基因表達

細菌sRNA 通過堿基配對與靶mRNA 的編碼區或非翻譯區結合，這是sRNA 調控基因表達的主要方式，主要影響靶mRNA 的翻譯或（和）穩定性產生，促進或降低mRNA 的翻譯和降解。

1.1.1 順式編碼的sRNA

順式編碼的sRNA，亦稱反義RNA，通常是由其所調控靶標基因的互補鏈轉錄而來，位于與其所調控的mRNA 互補的位置上，且編碼在相反的鏈上，二者的堿基完全互補配對[17]。順式編碼的sRNA 主要分布在質粒、轉座子中[18]，可與靶標mRNA 完全互補配對調控目標基因的表達，該類sRNA 調控的基因大都與細菌毒力有關，例如大腸桿菌中的gadXW 操縱子受順式編碼sRNA 的調節[19]。

1.1.2 反式編碼的sRNA

反式編碼的sRNA 從與其靶RNA 基因完全不同的基因組位置轉錄而來[18]，與其靶mRNA 的堿基通過不完全互補配對的方式結合。有限的互補性使得反式編碼的sRNA 能夠與多個mRNA 結合，這一特征使其能全面地調控細菌的生理反應[20]。細菌sRNA 多為反式編碼RNA，這類sRNA 發揮功能通常需要分子伴侶蛋白協助?，F已發現的能在sRNA與mRNA 的結合中起作用的分子伴侶有Hfq 和ProQ 兩種。目前對Hfq 蛋白介導sRNA 與mRNA 結合的機制有兩種推測：一種是Hfq 改變了與之結合的sRNA 的結構，使其暴露出與靶mRNA 配對的序列，縮短了配對所需的時長；另一種是Hfq 增加了該空間某一區域內sRNA 和mRNA 的含量，使它們的結合幾率增大[21]。最新研究在細菌中檢測出一種新的分子伴侶蛋白ProQ，雖然它與sRNA 結合并穩定sRNA 的分子機制尚未清楚，但已證實能促進sRNA 和所調控的mRNA 的堿基配對[22]。

1.2 sRNA 與靶蛋白質作用從而影響其功能

sRNA 除了以堿基配對的方式發揮其調控功能外，能直接與靶蛋白相互作用影響毒力基因的表達。細菌中的6S RNA 能保證細菌各階段生存所需要的營養，降低對外界各種緊張性刺激物引起的細胞生理反應而儲存能量。6S RNA 能通過模擬一個開放的啟動子復合體，將RNA 聚合酶從靶啟動子置換下來，從而調節特定基因的表達[23]。例如CsrA蛋白最近被證明與細菌的毒力有關，它的表達受到CsrB 和CsrC 這兩種sRNA 的調控[24]。

1.3 sRNA 本身具有特殊活性

除上述sRNA 作用機制外，有一類sRNA 本身就具有特殊活性，如4.5S RNA、tmRNA 和M1 RNA等。4.5S RNA 能結合信號識別顆粒和它的受體共同把蛋白質運輸到特定的內質網或細菌質膜，影響蛋白質的分泌過程。倘若該基因缺失，將抑制蛋白質的合成。tmRNA 在各種細菌中均有發現，既具有tRNA 的功能，又具有mRNA 的作用[25]。tmRNA 可監控細菌蛋白質合成的過程和停滯蛋白質水解的過程，有助于調控基因表達的速度和精確度[26]。M1 RNA 具有典型的內切酶活性，能夠對tRNA 5' 末端進行剪切并形成成熟的tRNA[27]。

2 sRNA 在水生動物致病菌中的研究進展

目前在溶藻弧菌中已被鑒定的sRNA 有750 余個，在殺魚愛德華氏菌中已被鑒定的sRNA 有150余個，在無乳鏈球菌中已被鑒定的sRNA 有197 個，在魯氏耶爾森氏菌中已被鑒定的sRNA 有2 個，在維氏氣單胞菌中已被鑒定的sRNA 有1 個，在副溶血性弧菌中已被鑒定的sRNA 有1 個，已經進行研究的sRNA 大都被發現與細菌抗逆性、運動性和致病性相關，個別sRNA 與細菌對碳源和氮源的利用、細胞外多糖含量和產生絲氨酸蛋白酶的能力相關，具體內容如下。

2.1 溶藻弧菌sRNA

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是革蘭氏陰性病原菌[28]，是一種機會性病原體[29]，可感染、引發多種水生動物疾病[30]，給水產養殖業造成巨大的經濟損失。Liu 等[31]發現，溶藻弧菌中sRNA 伴侶Hfq 的缺失導致溶藻弧菌對滲透壓力、高溫和鐵饑餓等環境壓力更加敏感，運動性和生物膜形成能力消失，毒力基因表達下調等，表明sRNA 可能與溶藻弧菌的逆境適應及毒力相關。2018 年Deng 等[10]鑒定了溶藻弧菌sRNA srvg23535，發現srvg23535 保守性高且僅存在于弧菌中；通過構建sRNA 的敲除株發現srvg23535 在碳源和氮源的利用以及滲透壓和pH脅迫反應中發揮了重要作用。Deng 等[11]發現sRNA srvg17985 的缺失導致溶藻弧菌對Gly-Glu 碳源的利用減少，對NaCl 耐受性更強，但對尿素的耐受性更弱；在pH=9.5 時sRNA srvg17985 抑制L-絲氨酸的脫氨基作用，促進X-β-d-葡糖苷酸的水解，影響堿脅迫反應。

直到2019 年，溶藻弧菌sRNA 才得到系統性鑒定。Peng 等[32]鑒定了溶藻弧菌中749 個sRNA，其中128 個sRNA 響應氧化應激壓力，相應地有1 870 個基因也響應氧化應激壓力；并發現這些sRNA 可能調控與鐵轉運、過氧化氫酶、GSH 依賴性防御系統、電子傳遞和應激反應等相關基因的表達。周欣等[33]鑒定了溶藻弧菌5 個細胞密度依賴性sRNA，發現它們均具有Hfq 結合位點區，對群體感應系統核心元件LuxR 和AphA 具有調控作用；發現這些sRNA或通過激活周生鞭毛合成蛋白LafK 和LafA 調控細菌的泳動能力，或作用于極生鞭毛合成相關蛋白FliS 和FlaK 影響游動能力，或調控生物被膜調控因子SypG 來影響生物被膜的形成。最近，Liu 等[12]發現，與野生型菌株相比，溶藻弧菌sRNA Qrr 突變體的生長能力顯著減弱，運動性減弱，形成生物膜的能力增強，細胞外多糖含量增加，產生絲氨酸蛋白酶的能力增強，LD50值增大。

2.2 殺魚愛德華氏菌sRNA

殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida），又稱遲緩愛德華氏菌（E.tarda）是一種重要的魚類病原菌，每年給全世界的水產養殖業造成了巨大的經濟損失[34]。雖然殺魚愛德華氏菌中的多種毒力因子（或系統）如黏附因子、鐵攝取調節因子、抗血清能力、Ⅲ與Ⅵ型分泌系統已被鑒定和闡析[35]，但對sRNA的研究可以從一個新角度揭示殺魚愛德華氏菌復雜的毒力基因調控網絡。早在2014 年，Hu 等[36]發現sRNA 分子伴侶Hfq 的缺失下調了殺魚愛德華氏菌多個毒力基因的表達，降低了細菌的抗逆性和致病性。2017 年，通過生物學信息學分析，Sun 等[37]在殺魚愛德華氏菌中預測了10 個sRNA，其中2 個sRNA 與tmRNA 和GcvB 同源，其余8 個為未報道的sRNA。這些sRNA 預測的靶基因直接或間接與毒力相關，表明sRNA 可能參與了殺魚愛德華氏菌致病性。2018 年，Du 等[38]利用RNA-seq 技術首次系統鑒定了殺魚愛德華氏菌sRNA，發現了148 個sRNA，其中129 個為新sRNA。在逆境（酸性、缺鐵和氧化壓力）條件下，103 個sRNA 表達出現差異（DEsRNA），同時1 615 個mRNA 的表達也發生了顯著變化（DEmRNA）。基于IntaRNA 預測、DEsRNA與DEmRNA 之間的相關性分析，預測有103 個DEsRNA 調節769 個靶mRNA。靶基因的功能分析表明，sRNA 廣泛參與多種生理活動，包括抗逆性和致病性，進一步的感染試驗證實sRNA 參與了E.piscicida 的致病性。靶基因中包含了大量的轉錄因子，表明sRNA 很可能與殺魚愛德華氏菌復雜的基因調控系統有非常密切的關系。這些結果表明，sRNA 在殺魚愛德華氏菌抗逆性和致病性中起著重要作用。隨后，周海珍等[13，14]通過構建sRNA 的缺失突變株，發現sR082 參與了殺魚愛德華氏菌的耐酸壓力，而sR012 參與了殺魚愛德華氏菌的抗氧化壓力，明確了sR082 和sR012 在細菌感染宿主細胞、侵染組織等致病過程中起重要作用。Gao 等[15]鑒定了3 個sRNA，發現EsR240 與抗酸性、抗氧化性密切相關，EsR240 缺失突變株顯著降低了殺魚愛德華氏菌對宿主的侵染能力，其LD50升高了近7 倍。這些研究結果充分表明，sRNA 是殺魚愛德華氏菌的抗逆性和致病性重要的調節者。

2.3 其他水生動物致病菌sRNA

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是革蘭氏陽性病原菌[39]，還是一種人獸共患病原菌[40]，能引發魚類無乳鏈球菌病，該細菌經常爆發已造成嚴重的經濟損失。Pichon 等[16]鑒定了無乳鏈球菌中的197 個sRNA/asRNA 基因，并發現SQ18、SQ485 和SQ893 三個sRNA 對相鄰基因的表達有調控作用，而SQ18 asRNA 通過反義機制下調Sip 基因的表達。

魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）是一種革蘭氏陰性桿狀腸桿菌[41]，與許多腸道細菌一樣，它是一種兼性細胞內病原體[42]，能引發腸炎紅嘴病[43]，導致全球鮭魚養殖業遭受重大經濟損失。Acu?a等[44]發現，RyhB-1 和RyhB-2 兩個sRNA 對該致病菌的胞內增殖能力具有調控作用，還調節與鐵穩態、代謝和運動性相關基因的表達。

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）是革蘭氏陰性病原菌[45]，一種水生環境中大量存在的魚-人-畜機會致病[46]，能引起淡水魚敗血癥和潰瘍綜合征[47]。研究發現，sRNA AvrA 能調控iscR mRNA 來增加該致病菌的SmpB 突變株對氧化應激的耐受性[48]。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水生革蘭氏陰性病原菌[49]，是一種模式海洋細菌[50]，作為一種機會致病菌導致全球范圍內的海產品感染，造成巨大的經濟損失[51]。不同于其他細菌中的sRNA Qrr2，副溶血性弧菌中的sRNA Qrr2 獨立于sigma-54 表達，可作為唯一的Qrr sRNA 來控制該菌中的群體感應，進而影響毒力的表達[52]。

3 結語和展望

近年來，科研工作者已在溶藻弧菌、殺魚愛德華氏菌、無乳鏈球菌、魯氏耶爾森氏菌、維氏氣單胞菌、副溶血性弧菌等水生動物致病菌中鑒定出上千個sRNA，現有的研究表明sRNA 是細菌適應環境變化和侵入宿主所需的調控網絡的一部分，在病原菌對碳源和氮源的利用、氧化壓力脅迫、缺鐵脅迫、pH 脅迫、運動性和毒力等方面發揮重要作用，但sRNA 調控機制研究的廣度和深度還明顯不夠。加強sRNA 調控機制的研究將對發展以sRNA 為靶標的疫病防控新技術提供理論基礎和新思路。