用DNA 宏條形碼技術(shù)分析鵠沼枝額蟲的食性

陳江，吳俁學(xué)，王艷艷，姚俊杰，何浩宇

（1.貴州大學(xué)漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025）

食性分析是攝食生態(tài)學(xué)（trophic ecology）的主要內(nèi)容之一和動(dòng)物個(gè)體及種群研究的基礎(chǔ)。目前，食性分析的方法主要有胃內(nèi)容物分析法、穩(wěn)定同位素法和直接觀察法。在魚類等水生動(dòng)物食性研究中，主要采取胃內(nèi)容物形態(tài)學(xué)鑒定分析法[1,2]，但已被消化的碎屑食物、糜等無法鏡檢觀察判斷種類[3]。小型水生動(dòng)物攝食量小、腸內(nèi)容物分離困難，形態(tài)學(xué)的鑒定就更加困難[4]。

DNA 宏條形碼（DNA metabarcoding）技術(shù)是2012 年由Taberlet 等[5]研究提出，能更有效地分析胃內(nèi)容物，已廣泛運(yùn)用于土壤和水生態(tài)環(huán)境的多樣性監(jiān)測(cè)[6,7]、微生物菌群研究[8,9]、陸生動(dòng)物食性[10]和生物監(jiān)測(cè)[11]等。在水生動(dòng)物中，已開始利用宏條形碼技術(shù)來研究海蜇（Rhopilema esculentum）、塔型馬蹄螺（Tectus pyramis）、黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）等的食性[12-14]。

仙女蝦（fairy shrimp）是一種淡水小型甲殼動(dòng)物，是無甲目（Anostraca）一類動(dòng)物的統(tǒng)稱，是甲殼綱動(dòng)物中最具多樣性的分類單元[15]。仙女蝦的大部分物種是濾食性動(dòng)物[16,17]，極少數(shù)仙女蝦是捕食者[18]。2021 年9 月30 日，在貴州省都勻市甲登村一個(gè)池塘發(fā)現(xiàn)有仙女蝦，經(jīng)鑒定為鵠沼枝額蟲（Branchinella kugenumaensis），隸屬于釵額蟲科（Thamnocephalidae）枝額蟲屬（Branchinella）。鵠沼枝額蟲主要分布于中國(guó)、日本、朝鮮及印度南部，為淡水仙女蝦。潘茜等研究了餌料對(duì)鵠沼枝額蟲生長(zhǎng)和生殖力的影響。他們提到鵠沼枝額蟲主要以細(xì)菌、有機(jī)碎屑和單胞藻等為食，用豆腐、蝦片、米糠、大豆、面粉、小球藻6 種餌料培養(yǎng)鵠沼枝額蟲幼體[19]。鵠沼枝額蟲通過產(chǎn)生休眠卵來度過不利時(shí)期，條件適宜時(shí)，大量生長(zhǎng)、繁衍[20]。鵠沼枝額蟲出現(xiàn)時(shí)間和地點(diǎn)不確定，對(duì)其在自然界中的食性了解較少。本研究采用DNA 宏條形碼技術(shù)研究了鵠沼枝額蟲的食性，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其攝食特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在貴州省都勻市甲登村的一個(gè)池塘（E107°44'46.74"，N26°17'55.36"）采集鵠沼枝額蟲樣品。蟲體質(zhì)量（0.032±0.004）g，全長(zhǎng)（15.93±1.81）mm。

用滅菌后的器具在解剖鏡下快速取腸道放入無菌管中，用無水乙醇固定，然后放入裝有干冰的低溫盒。共采集50 尾鵠沼枝額蟲腸道，帶回實(shí)驗(yàn)室后，-80 ℃保存。

1.2 DNA 提取、文庫構(gòu)建和測(cè)序

使用OMEGA 的E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒提取鵠沼枝額蟲宏基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性，Qubit 定量檢測(cè)DNA 樣本濃度，質(zhì)檢合格后，將提取的DNA 用Covaris S220 聚焦超聲儀進(jìn)行剪切、回收，質(zhì)檢合格后，使用NEB NextUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒進(jìn)行文庫擴(kuò)建。測(cè)序以及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析由上海生工生物工程公司完成。

1.3 宏基因組拼接組裝、預(yù)測(cè)和物種注釋

將質(zhì)量控制后的讀長(zhǎng)用IDBA_UD 軟件拼接組裝成長(zhǎng)序列contig，根據(jù)讀長(zhǎng)間的overlap 關(guān)系，獲得contigs。使用Prodigal 軟件對(duì)組裝后的contigs 的開放式閱讀框進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用CD-HIT 軟件進(jìn)行聚類，每類取最長(zhǎng)的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集。使用DIAMOND 軟件將基因集蛋白序列與Nr 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp 同源性比對(duì)，得到同源物種信息。根據(jù)NCBI 的微生物分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，在界、門、綱、目、科、屬和種水平注釋物種信息。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，動(dòng)物統(tǒng)計(jì)序列相對(duì)量在0.1%以上的物種，考慮到水體中藻類的因素，植物統(tǒng)計(jì)序列相對(duì)量在0.001%以上的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果

樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果見表1。對(duì)鵠沼枝額蟲樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得有效序列61 146 906條，平均序列長(zhǎng)度138.54 bp。堿基質(zhì)量在Q30 以上的比列為93.52%，GC 堿基數(shù)目3 517 923 616 bp。

表1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果Tab.1 Quality control results of sample sequencing data

2.2 鵠沼枝額蟲的食物種類

鵠沼枝額蟲食物組成中各門的物種數(shù)見表2。在除去鵠沼枝額蟲自身序列、無法鑒定且數(shù)量較少的序列后，共獲得151 個(gè)物種，分屬于10 個(gè)門類:節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）、刺胞動(dòng)物門（Cnidaria）、脊索動(dòng)物門（Chordata）、線蟲動(dòng)物門（Nematoda）、軟體動(dòng)物門（Mollusca）、半索動(dòng)物門（Hemichordata）、環(huán)節(jié)動(dòng)物門（Annelida）、扁形動(dòng)物門（Platyhelminthes）、被子植物門（Angiospermae）和綠藻門（Chlorophyta）。食物序列最豐富的類群是節(jié)肢動(dòng)物門，共有83 種，其次是脊索動(dòng)物門和被子植物門，分別有27 種和14種，最少的是環(huán)節(jié)動(dòng)物門和半索動(dòng)物門，分別是2種和1 種。

表2 鵠沼枝額蟲食物各門物種數(shù)Tab.2 Number of species in the food items of fairy shrimp B.kugenumaensis in phylum level

鵠沼枝額蟲主要食性物種組成見表3。鵠沼枝額蟲主要的食性物種來自四個(gè)門：節(jié)肢動(dòng)物門、刺胞動(dòng)物門、脊索動(dòng)物門和半索動(dòng)物門，共有19 個(gè)物種。在綱水平，昆蟲綱有12 個(gè)物種，甲殼綱、蛛形綱各有2 個(gè)物種，水螅綱、鳥綱和腸鰓綱均只有1 個(gè)物種。

表3 鵠沼枝額蟲主要食性物種組成Tab.3 Species composition of food items in fairy shrimp B.kugenumaensis

從門水平上來看（圖1），節(jié)肢動(dòng)物門占據(jù)了食物序列總數(shù)的70%，脊索動(dòng)物門占11%，刺胞動(dòng)物門占5%，軟體動(dòng)物門占4%，線蟲動(dòng)物門占4%，半索動(dòng)物門占2%。植物所占食物序列的比例少，被子植物門0.7%、綠藻門0.3%。

圖1 鵠沼枝額蟲門水平上食物組成比例Fig.1 Food composition of fairy shrimp B.kugenumaensis at phylum level

在屬水平上（圖2），溞屬（Daphnia）占食物序列比例最高，為12%，其中大型溞（D.magna）占7%，蚤狀溞（D.pulex）占5%。其次是水螅屬（Hydra）占據(jù)食物序列的5%，其中Hydra littoralis 占據(jù)0.9%，水螅（Hydra vulgaris）占據(jù)4%。頂切葉蟻屬，占據(jù)食物序列的4%，物種為頂切葉蟻（Acromyrmex echinatior）。弓背蟻屬（Harpegnathos）占據(jù)食物序列的4%，物種為跳鐮猛蟻（Harpegnathos saltator）；鐮猛蟻屬（Camponotus）占據(jù)食物序列的3%，物種為佛羅里達(dá)弓背蟻（Camponotus floridanus），毛蟻屬（Lasius）占據(jù)食物序列的1%，物種為黑毛蟻（Lasius niger）。斑蝶屬（Danaus）、長(zhǎng)吻蟲屬（Saccoglossus）和鴿屬（Columba）占據(jù)食物序列的3%，均只有一個(gè)物種，分別為黑脈金斑蝶（Danaus plexippus）、Saccoglossus kowalevskii 和原鴿（Columba livia）。

圖2 鵠沼枝額蟲屬水平上食物組成比例（取相對(duì)含量前十五的屬）Fig.2 Food composition of fairy shrimp B.kugenumaensis at genus level

3 討論

3.1 鵠沼枝額蟲食性分析

飼喂實(shí)驗(yàn)和胃腸內(nèi)容物分析發(fā)現(xiàn)，大部分仙女蝦物種過濾水體中的有機(jī)顆粒來生存[16,17]，但不清楚有機(jī)顆粒的物種組成。本研究運(yùn)用DNA 宏條形碼技術(shù)，了解了鵠沼枝額蟲在自然水域中的濾食信息。鵠沼枝額蟲因體型差異、生活環(huán)境等因素的影響，無法捕食節(jié)肢動(dòng)物門、脊索動(dòng)物門、軟體動(dòng)物門等門類的個(gè)體較大的動(dòng)物，但檢測(cè)結(jié)果中這幾個(gè)門類的動(dòng)物占據(jù)了70%DNA 序列，這表明鵠沼枝額蟲是濾食水體中這些門類動(dòng)物的有機(jī)碎屑。

本研究觀察到，鵠沼枝額蟲以仰泳的形式游泳，頭部和腹面朝上，腹部附肢撥水游動(dòng)。Cannon 在闡述仙女蝦的攝食機(jī)制時(shí)認(rèn)為，食物顆粒是被一股明確的力帶向口腔，鵠沼枝額蟲的攝食是主動(dòng)過濾[16]。從形態(tài)學(xué)來看，鵠沼枝額蟲的唇是頭部在額附肢下方的延續(xù)，大致呈三角形，向后延伸，邊緣周圍有稠密的剛毛，外唇腺突出；下頜骨在口器的兩側(cè)，呈棒狀，前端有細(xì)小的齒和較大的棘；上頜骨較小，無節(jié)，邊緣具17～18 雙節(jié)羽狀剛毛[20]。鵠沼枝額蟲的口器上下都具有剛毛，有利于鵠沼枝額蟲過濾水體中的有機(jī)顆粒。鵠沼枝額蟲的齒和棘的可將較大的食物顆粒切碎。本研究結(jié)果中大型蚤體長(zhǎng)在1.75～6.00 mm，蚤狀溞體長(zhǎng)在0.91～3.36 mm。鵠沼枝額蟲個(gè)體較大，可用齒和棘切碎后進(jìn)入腸道。

鵠沼枝額蟲是主動(dòng)濾食。從食物組成中發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物成分占據(jù)了99%，植物成分只占0.9%，是否說明鵠沼枝額蟲的食物組成是以動(dòng)物蛋白為主呢？有關(guān)研究表明，仙女蝦的濾食無選擇性，即各種動(dòng)植物死后在水中降解為有機(jī)碎屑被其隨機(jī)濾食[21]。鵠沼枝額蟲也同樣如此，它通過葉足運(yùn)動(dòng)來攝食，對(duì)于環(huán)境中的有機(jī)碎屑無法選擇，均被其濾食。食物成分的動(dòng)物與植物的占比，只能說明該水體中動(dòng)物有機(jī)碎屑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物有機(jī)碎屑量。

3.2 DNA 宏條形碼技術(shù)鑒定小型水生動(dòng)物食性物種的優(yōu)勢(shì)

在DNA 宏條形碼技術(shù)出現(xiàn)以前，對(duì)仙女蝦等小型水生動(dòng)物的食性研究大多采用飼喂實(shí)驗(yàn)、胃腸內(nèi)容物分析方法[17,22-24]。如Brendonck 將一種仙女蝦（S.proboscideus）養(yǎng)殖在不同密度海藻細(xì)胞的懸浮液中，觀察其濾過率和攝食率[23]；Metens 等[24]用纖毛蟲、輪蟲、團(tuán)藻、線蟲和小型甲殼動(dòng)物作為食物喂養(yǎng)S.proboscideus 研究其食性和攝食機(jī)制；Bernice分析了另一種仙女蝦（Spreptocephlas dichotomus）腸道內(nèi)容物，發(fā)現(xiàn)了浮游動(dòng)植物和甲殼動(dòng)物碎片，認(rèn)為浮游植物是S.dichotomus 的主要食物來源，也認(rèn)為它的濾食無選擇[22]。這些研究工作多在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，相對(duì)于復(fù)雜自然水體，實(shí)驗(yàn)室條件可控；胃腸內(nèi)容物分析雖然可以觀察到野外仙女蝦的部分食物種類，但對(duì)“甲殼動(dòng)物碎片”、濾食有機(jī)顆粒和已消化或半消化食物，則難以通過形態(tài)學(xué)鑒定。

DNA 宏條形碼技術(shù)的發(fā)展，為小型水生動(dòng)物的食性研究提供了極大的便利。本研究中，對(duì)鵠沼枝額蟲整個(gè)腸道的測(cè)序準(zhǔn)確地定性分析了野生鵠沼枝額蟲濾食有機(jī)碎屑的食物物種組成，這是飼喂實(shí)驗(yàn)、胃腸內(nèi)容物分析等方法難以獲得的結(jié)果。DNA宏條形碼技術(shù)在食性分析中具有對(duì)餌料生物的分辨率和準(zhǔn)確性高，可以分析已經(jīng)被消化的餌料生物，在水生動(dòng)物食性分析中將發(fā)揮重要作用。

小結(jié)

采樣DNA 宏條形碼技術(shù)鑒定了自然水域中鵠沼枝額的食性。共鑒定出10 個(gè)門的151 個(gè)物種，獲得了大量具體食物物種的信息。研究表明，在自然水體中，鵠沼枝額蟲的食物來源與其出現(xiàn)的水體環(huán)境密切相關(guān)，其獲取食物的方式是主動(dòng)濾食，食物種類無選擇性，但可以用齒和棘切碎個(gè)體較大的大型蚤和蚤狀溞。

在以后的研究中，期望在更多不同的水體獲得鵠沼枝額蟲，測(cè)定與分析食性，獲得更多、更全面地對(duì)鵠沼枝額蟲食性的深入認(rèn)識(shí)。