銀鯽致病維氏氣單胞菌分離鑒定及生物學特性分析

董思思，伍勇，2，蔚思琪，陳存，2，薛飛龍，2，程馳，2，楊堃

（1.成都師范學院化學與生命科學學院，四川 成都 611130；2.特色園藝生物資源開發與利用四川省高校重點實驗室，四川 成都 611130）

我國水產養殖業規模的擴增，養殖過程產生的殘餌、動物殘骸和排泄物等給水體環境造成巨大壓力，水體條件惡劣下，單胞菌屬類細菌性疾病容易爆發。維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）屬于弧菌科氣單胞菌屬的兼性厭氧革蘭氏陰性桿菌，是一種常見水生生物患病菌，與動物疾病關聯，可引起胃腸炎、腹膜炎、敗血癥等[1]。維氏氣單胞菌對水生變溫動物感染性高，如錦鯉（Cyprinus carpio）[2]、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[3]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[4]、羅非魚（Oreochromis mossambicus）[5]等。感染該菌后，魚類往往出血、敗血，發病快、死亡率高，對水產養殖業經濟損失巨大[6]。

生產中往往用抗生素或化學藥物治療細菌性疾病[7]。長期使用抗生素不僅污染，還促使出現耐藥性，誘發一系列水生態環境和水產品安全問題。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為益生菌中的一大類，具有改善水體生態環境、抑制有害菌的生長的作用，是水產養殖中經常使用的微生態制劑[8]。但是，在金鯽（Carassius auratus red var.）細菌性（維氏氣單胞菌）腸炎預防中，枯草芽孢桿菌是否能降低致病菌的毒性，還需要進一步驗證。其致病機理復雜，通常需要鑒定其毒力基因。目前維氏氣單胞菌的鑒定主要依靠生理生化方法，也有人應用分子生物學和免疫學方法進行鑒定[9]。微生物宏基因組學是指所有微生物遺傳物質的總和，包括可培養和不可培養的微生物基因。宏基因組數據分析主要包括組成分析和功能分析[10]。通過致病菌的宏基因組測序及數據分析，可以檢測到致病菌的毒力因子、抗生素抗性基因的預測等，為進一步解析致病菌的致病機制以及篩選潛在抑菌藥物提供理論依據。

目前，已報道的用于水生動物細菌病防控的微生物數量有限，本研究從魚體樣本中分離病原菌株，進行形態學觀察和種屬鑒定，鑒定該致病菌種類，研究其生物學特性（致病菌侵染驗證；該菌侵染的體內、體外生物干預），以期為進一步探究單胞菌類誘發的金鯽細菌性敗血癥的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

10 尾異育銀鯽樣本來源于四川內江某水產養殖場；枯草芽孢桿菌由成都師范學院實驗室提供；50 尾健康金鯽（Carassius auratus）體質量為（7.29±2.21）g，體長為（10.1±1.00）cm，來自成都市漁場。

CAT 試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；革蘭氏染液、普通培養基、LB 培養基、，細菌微量生化反應管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化

試驗魚經75%酒精體表消毒后，無菌操作剪開腹部，取肝臟、脾臟、腹水等組織，分別劃線于普通瓊脂平板，28 ℃培養24 h 后，挑去形態特征一致的優勢菌落進行分離純培養2～3 次，獲得純化的菌株，保種后4 ℃冰箱保存，以便進一步研究。

1.2.2 病原菌種屬鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定

將分離純化后的細菌接種于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上，28 ℃培養24 h，將分離純化的菌株進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察菌體染色特性及形態，按照維氏氣單胞菌生化鑒定圖譜選擇微量生化鑒定管，超凈工作臺內接種至微量生化鑒定管，置于30 ℃恒溫箱培養24 h 后觀察，參照判定手冊和標準管結果進行判定。

1.2.2.2 分子鑒定

樣品要求：用于抽提基因組DNA 的菌體以對數生長中期細胞最佳。將篩選出的致病菌液體培養過夜，測定在600 nm 時的OD 值。將菌液4 ℃離心，液氮處理1 h 后，-20 ℃凍存，以備后續的細菌宏基因組測序分析。DNA 總量及濃度要求收集不少于3 OD 的菌液對應的菌體沉淀（例：OD600=2，則需要取1.5 mL 菌液離心收集菌體；OD600=0.5，則需要取6 mL 菌液離心收集菌體）。

擴增引物為27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）、1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。對分離菌的16S rRNA 基因序列通過NCBI 的Blast 檢索進行同源序列分析，并使用MEGA7.0 軟件與GenBank 數據庫中同源性較高的序列進行多序列對比，采用鄰接法構建系統發育樹。

1.3 病原菌生物學特性試驗

1.3.1 宏基因組測序分析

將液氮處理后的菌液送美吉生物公司做細菌宏基因組掃描，利用毒力因子數據庫（VFDB,Virulence Factors of Pathogenic Bacteria[11]）和抗生素耐藥基因數據庫（CARD，the Comprehensive Antibiotic Research Database[12]）對分離菌株進行基因注釋，并分析全基因組中所包含的毒力基因和耐藥基因。

1.3.2 動物回歸試驗

人工感染金鯽：挑選健康的金鯽20 尾，隨機分成兩組，每組10 尾。一組注射致病菌（維氏氣單胞菌）菌懸液，以注射無菌生理鹽水作為對照，根據參考文獻中的維氏氣單胞菌的致病劑量適當調整，注射劑量為0.2 mL/ 尾（致病菌菌液濃度：6×108cfu/mL），水溫（24±1）℃下飼養48 h，觀察魚的發病情況。

1.3.3 體外共培養實驗

將分離菌和枯草芽孢桿菌分別接種于營養肉湯液體培養基中，以未接種的空白培養基作為對照，每隔0.5 h 取樣測定OD 值[13]，整個培養期11 h，繪制細菌的生長曲線。為檢驗枯草芽孢桿菌對該致病菌生長的影響，采用牛津杯法，取致病菌菌液0.2 mL 涂布于普通培養基，在牛津杯中注入枯草芽孢桿菌菌液，28 ℃培養12 h 后觀察是否產生抑菌圈。

1.3.4 動物體內細菌感染實驗

給金鯽腹腔注射接種維氏氣單胞菌[14]，實驗包含實驗、對照、治療和空白對照四個組，實驗組注射致病菌+無菌生理鹽水，對照組注射枯草芽孢桿菌，以注射枯草芽孢桿菌＋致病菌混合液作為治療組，混合的比例為1∶1，空白對照組注射無菌生理鹽水，保持致病菌的接種劑量一致，每尾魚的劑量為0.2 mL（致病菌菌液濃度：6×108cfu/mL，枯草芽孢桿菌菌液濃度：2×108cfu/mL），每組15 尾魚，分別在實驗的第6 h、12 h、18 h 取5 尾魚采血樣，觀察金鯽成活狀況，用于后續CAT 酶活測定，參考試劑盒說明書測定CAT。具體為：取5 μL 的全血加入無菌水稀釋至0.5 mL（1∶99 溶血液），充分混勻放置10 min，取0.05 mL 血液加入1 mL 試劑1（37 ℃預熱）以及0.1 mL 試劑2（37 ℃預熱），充分混勻，在37 ℃下準確反應1 min 后加入1 mL 試劑3；空白管中血液用雙蒸水代替；對照管中試劑1、試劑2 和試劑3 用雙蒸水代替。檢測波長405 nm，比色杯的光徑0.5 cm，以雙蒸水調零測定。

其中，*271 為換算常數，血紅蛋白含量取參考值1 mgHb/mL。

1.4 數據分析

用Diamond（http://www.diamondsearch.org/index.php，version 0.8.35）將宏基因組測序結果的非冗余基因集的氨基酸序列與VFDB 核心數據庫進行比對，比對參數設置期望值e-value 為1e-5，獲得基因對應的毒力因子注釋信息，將沒比對上的序列再次比對VFDB 預測數據庫[15]。

同樣使用Diamond（http://www.diamondsearch.org/index.php，version 0.8.35）將非冗余基因集的氨基酸序列與ARDB（version 1.1）或CARD（version 3.0.9）數據庫進行比對（BLASTP 比對參數設置期望值e-value 為1e-5），獲得基因對應的抗生素抗性功能注釋信息后，用抗生素抗性功能對應的基因豐度總和計算該抗生素抗性功能的豐度[15]。

2 結果與分析

2.1 菌落形態特征

病原菌革蘭氏染色表明，該菌為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下該菌呈短桿狀，邊緣光滑整齊。在普通平板培養基上菌落呈圓形，中央微隆，邊緣較整齊。

2.2 生化鑒定結果

按照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》進行生理生化特性鑒定。該菌對葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、D-核糖、阿拉伯糖、硫化氫、明膠等生化反應結果為陽性，對七葉苷、鳥氨酸脫羧酶檢測為陰性。根據結果初步確定分離菌株應為氣單胞菌屬。

2.3 16S rRNA 基因擴增及序列分析結果

致病菌的16S rRNA 產物經瓊脂糖膠電泳（圖1）和鄰接法構建系統發育樹（圖2）顯示，分離菌株JF1231 與維氏氣單胞菌（HY6）同屬一枝，同源性高達99%。結合生化等結果，可確定分離株JF1231 為維氏氣單胞菌。

圖1 致病菌PCR 產物Fig.1 PCR products of pathogenic bacteria

圖2 鄰接法構建系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree construction by the neighborjoining method

2.4 病原菌的宏基因組測序

2.4.1 基因注釋

對菌株JF1231 采用二、三代聯合測序方案進行全基因組測序，分析和預測其序列長度、GC 含量、功能注釋等基本特征。該菌株基因組為4 493 251 bp，GC 含量為58.67%，編碼基因4 106 個，Scaffold的總數量為165 個和249 個Contig，122 個tRNA 和13 個rRNA。COG 注釋信息中（圖3）主要包括氨基酸的轉運與代謝、能量生產與轉換和無機離子轉運與代謝等。GO 注釋分別將該菌株基因組注釋到3大類2 493 個基因上（圖4）。該菌株注釋的代謝途徑基因豐富而完整。這些基因主要參與碳水化合物的代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素的代謝等，使生物體能不斷地交換物質和能量，維持自身活動所需的物質并及時響應外部環境。

圖3 基因編碼蛋白COG 功能分類統計Fig.3 Functional classification statistics for the gene encoding protein COG

圖4 基因編碼蛋白GO 功能分類Fig.4 Gene encoding protein GO functional classification

2.4.2 毒力基因預測結果

VFDB 注釋（圖5）共獲得582 個致病毒力基因。這些基因包括非特異性毒力因子、防御毒力因子、攻擊性毒力因子和毒力相關基因的調控。其中離子吸收系統和黏附分泌系統所占基因比例較大，表明該菌具有很強的腸道黏附性，使金鯽腸炎病發作。

圖5 毒力因子統計圖Fig.5 Toxicity factor statistical chart

2.4.3 耐藥基因預測結果

經CARD 數據庫比對，共獲得216 個耐藥基因，預測耐藥基因（圖6）主要分為四環素類抗生素、大環內酯類抗生素、氟喹諾酮類抗生素、佩南和酚鑭抑制劑等。

圖6 耐藥基因預測分類統計圖Fig.6 Statistical map of the predicted classification of drug resistance genes

2.5 回歸感染試驗結果

人工感染了從患病魚體中分離出的菌株JF1231 的健康金鯽鱗片脫落又無光澤，眼球突出，肛門紅腫，胸部、腹部和鰭明顯充血，鰓呈絲紅色和潰瘍（圖7）。切開后金鯽有大量腹水，腸壁透明，符合細菌性敗血癥的臨床癥狀。

圖7 接種前后魚體的外觀觀察對比Fig.7 Comparison of the appearance of the fish before and after inoculation

2.6 體外共培養實驗結果

以培養時間為橫坐標和OD600nm為縱坐標，繪制枯草芽孢桿菌和致病菌JF1231 的生長曲線（圖8、圖9），枯草芽孢桿菌的對數生長期在1.5～9.5 h，而致病菌在1.5～8.5 h，枯草芽孢桿菌前期生長速度優于致病菌，而在后期致病菌增長更為迅速。圖10 可以看出，在牛津杯周圍有清晰可見的透明圈，說明枯草芽孢桿菌對病原菌JF1231 有一定的抑制作用。

圖8 致病菌的生長曲線Fig.8 Growth curve of pathogenic bacteria

圖9 枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.9 Growth curve of Bacillus subtilis

圖10 枯草芽孢桿菌與致病菌共培養Fig.10 Co-culture of Bacillus subtilis with pathogenic bacteria

2.7 動物體內細菌感染實驗

腹腔注射菌液18 h 后，實驗組魚鱗片脫落且鱗片無光澤，眼球突出，肛門紅腫，胸部、腹部和鰭明顯充血；對照組未見異常；治療組眼球突出不明顯，胸部、腹部和鰭明未有明顯充血現象；空白對照組未見異常。

由圖11 可知，各組的過氧化氫酶活性隨著時間都有所變化，隨時間變化逐漸下降，其余三組在12 h 時有所下降，18 h 時有明顯上升。實驗組由于致病菌的浸染，可能造成魚體暫時的代謝紊亂、酶失活或酶合成受阻，引起CAT 活性下降到低于空白對照水平。對照組血液中過氧化氫酶活性低于治療組，說明枯草芽胞桿菌能部分減輕維氏氣單胞菌對金鯽的毒害作用。

圖11 不同時間段各組的CAT 活力Fig.11 CAT activity of each group at different time periods

3 討論

氣單胞菌參與誘導了魚體敗血癥和潰瘍綜合癥，維氏氣單胞菌在多種宿主中作為主要或者條件性疾病的病原體[16]。本實驗所分離的病原菌JF1231為維氏氣單胞菌，可介導金鯽的細菌性敗血癥，這與報道的結果一致[17]。細菌毒力是影響機體CAT 活性，降低機體的抗氧化和防御功能酶[13]）。本實驗發現，感染組CAT 活性迅速下降，再次驗證了該菌的毒性，但生物體可以通過調節抗氧化酶的活性來提高去除活性氧的水平，減少對機體的傷害[18,19]。本實驗中，預防組血液中過氧化氫酶活性比處理組有所回升，表明枯草芽胞桿菌能部分減輕維氏氣單胞菌對金鯽的毒害，這與報道的枯草芽孢桿菌BHI344可抑制嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌的結果一致[14]。

細菌生物學特征分析表明，病原菌JF1231 的致病力與毒力基因攜帶呈一定正相關，預測毒力基因可以進一步了解病原菌的致病機制，在分子層面了解病原菌對魚體侵害的主要原因。Krzyminska等[16]發現，單胞菌的致病力與act 基因有關，其誘導的活性氧和一氧化氮可破壞細胞膜的結構，所產生的氣溶素[17]能夠在宿主體內破壞細胞膜，導致宿主細胞壞死或臟器出血。本研究中，通過對致病菌（維氏氣單胞菌）毒力基因預測，篩選出可信度和相似度較高的三種基因[Polar flagella（VF0473）、Tap type IV pili（CVF783）和StcE（VF0209）]。這些毒力因子在激發促炎癥反應中發揮作用，可導致組織損傷、腸道水腫和血小板減少，其機制或與act 基因和氣溶素有關。除此之外，McDermott 等[20]通過全基因組測序分析非傷寒沙門氏菌的耐藥基因，解析了細菌對氨基糖苷類、四環素類、β-內酰胺類、喹諾酮類、磺酰胺類和大環內酯類等耐藥性。但不同動物源的維氏氣單胞菌對抗生素的耐藥性也存在差異，可能是與其染色體或質粒上攜帶的耐藥基因有關[21]。本研究也解析了維氏氣單胞菌的耐藥性，如四環素類抗生素、大環內酯類抗生素、氟喹諾酮類抗生素、佩南和酚鑭抑制劑等，這對于該菌的生物防治和抗生素的使用提供了理論參考。

結論：本試驗所分離鑒定的病原菌JF1231 為維氏氣單胞菌，通過毒性基因篩選和耐藥性分析驗證了該菌的致病性，而枯草芽胞桿菌可作為該菌的生物干擾菌的選擇。