草魚肌纖維原代培養的適宜培養基篩選

張浩，龍鮮梅，陳旺旺，胡廣文，譚青松

（華中農業大學水產學院，水產養殖國家級實驗教學示范中心，湖北 武漢 430070）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、草魚屬，具有生長快、肉質鮮美、價格親民等特點，是我國重要的經濟魚類[1]。隨著水產業發展和配合飼料的普及，草魚產量大幅度提升，養殖效益逐年遞增，但草魚肌肉品質也有所降低[2]。骨骼肌是魚體可食部分的主要組成，占魚體總質量的30%～80%，肌肉的基本組成單位是肌纖維，肌纖維特性是肉質的組織學基礎，細胞結構、肌纖維密度、橫截直徑和面積等都會影響肌肉品質[3]。隨著動物細胞體外培養研究的深入，骨骼肌細胞為動物肌肉生長研究提供了重要技術手段[4]。1965 年，GRAVELL 等[5]對黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）建立了第一株魚類肌肉細胞系—FHM，FHM目前仍是魚類肌細胞相關實驗的首選細胞系。草魚的肝原代細胞[6]、前體脂肪細胞[7]以及腸上皮細胞[8]等組織細胞已被分離培養，并應用到病理學、營養代謝及遺傳育種等研究，但草魚肌肉細胞用于營養生理、肌肉品質等研究仍然缺乏。

目前DMEM、M199、DMEM/F12、L-15 以及F12等普遍應用于魚類細胞培養[9]，而在魚類原代細胞培養中，最常用的培養基是L-15 和M199[10]。這些培養基含有細胞生長所需的多種營養成分，但不含蛋白質、脂類或任何生長因子，需要添加血清以支持長期培養。其中M199 培養基含有較多氨基酸、維生素以及其它營養成分，且含有胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷等獨有成分，因此M199 培養基可用于培養多種種屬來源的細胞，現也常用于淡水魚類細胞的培養。DMEM（高糖型）是一種應用十分廣泛的培養基，普遍適用于生長快、主要以糖代謝為主的組織細胞的培養[11]。L-15 培養基用半乳糖作為碳源，有利于減少細胞代謝過程中產生對細胞有毒性的酸性代謝副產物，而且其培養基的緩沖系統是由磷酸鹽和高濃度的堿性氨基酸組成，這些特性使得L-15 培養基不需要在CO2環境中進行細胞培養，更加簡化了細胞培養條件，近些年廣泛應用于魚類細胞培養[12]。不同培養基的物質組成比例及含量存在較大區別，關于不同培養基對草魚肌纖維原代培養的作用效果缺乏直接研究。為了確定草魚肌纖維原代培養的最佳培養基，本實驗選用3 種應用范圍較廣的M199、DMEM 和L-15 培養基進行草魚肌纖維的培養，通過探究在不同培養基條件下的培養情況，從而篩選適合進行草魚肌肉細胞原代培養的培養基。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗所用草魚均來自黃岡市太白湖漁場。在華中農業大學水產養殖基地養殖缸里統一飼養一段時間。在實驗開始前挑選無病無傷，體質健康，體長10～15 cm 的草魚苗。

1.2 主要試劑

培養基M199、DMEM、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自Gibico 公司；二甲亞砜（DMSO）、培養基L-15 購自浙江吉諾生物醫藥技術有限公司；硫慶大霉素、兩性霉素B、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、噻唑藍（MTT）購自Sigma 公司。

AIM 培養基：以體積比計，在（DMEM、M199 或L-15）培養基中加入5%的青霉素/鏈霉素雙抗溶液，5%的兩性霉素B（250 μg/mL）和1%的硫慶大霉素（10 mg/mL）；完全培養基配置：以體積比計，在DMEM、M199 或L-15 培養基中加入2%的青霉素/鏈霉素雙抗溶液，5%的兩性霉素B（250 μg/mL）和1%的硫慶大霉素（10 mg/mL），20%的胎牛血清；MTT 溶液配置：500 mg 的MTT 溶于100 mL 的PBS。

1.3 方法

草魚肌肉原代細胞分離和傳代培養 用解剖針破壞魚腦，并用75%酒精消毒。剪取魚體側線以上白肌，置于盛有AIM培養基的培養皿內消毒。后將組織塊切成1 mm3的小塊，接種于25 mL 培養瓶中。將培養瓶置于28 ℃、含5%CO2的培養箱內，使組織小塊貼附瓶底，然后將殘余液體吸出，再加入4～5 mL 完全培養基，將培養瓶放入培養箱繼續培養。每2～3 d 換液一次。待細胞出現大量集落，即進行傳代。當細胞培養至80%～90%的融合時，棄培養液，剝離組織塊，PBS 清洗去除死細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，待細胞由梭形變為圓形，立即加入含20%胎牛血清的培養基終止消化，收集單細胞懸液，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，加10 mL 含20%胎牛血清的培養液重懸細胞，按照1∶1 傳代，培養條件與原代培養相同。

1.3.1 不同培養基培養對草魚肌纖維生長情況及形態的影響

分別用DMEM、L-15 和M199 三種完全培養基培養草魚肌纖維，在倒置顯微鏡下觀察組織塊細胞在小塊貼壁后開始沿瓶壁向外生長的時間以及細胞形態，計數細胞開始遷出組織塊和達到第一次傳代條件（即培養瓶中的肌細胞達到80%～90%的融合狀態）所需時間。

1.3.2 不同培養基對草魚肌纖維增殖的影響

分別取用DMEM、L-15 和M199 三種完全培養基培養的P2代生長良好的草魚肌纖維，向培養瓶里加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶溶液消化，離心分離制成細胞懸液，以5.0×105/mL 接種于24 孔板，每孔0.5 mL，接種時間記0 h，自接種時算起，每24 h 用細胞計數儀計數3 孔細胞密度，算出均值，繪制細胞生長曲線。另取三種完全培養基分離培養的P2代生長良好的草魚肌纖維細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以4.2×104/mL 接種于12 孔板，每種培養基3孔，72 h 取樣，用流式細胞儀計數細胞數量，計算不同培養基培養的草魚肌纖維的擴增倍數（擴增倍數＝n 代收獲的細胞數/n 代接種的細胞數）。

1.3.3 不同培養基對草魚肌細胞貼壁的影響

分別取用DMEM、M199 和L-15 培養基培養的P3代草魚肌纖維，用0.25%胰蛋白酶消化，以2.0×105/mL 濃度接種于24 孔板中，每孔2 mL，置于28℃5% CO2培養箱中；每隔2 h，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并計算貼壁率，貼壁率（%）＝貼壁細胞數/接種細胞數×100%。

1.3.4 不同培養基培養細胞對細胞活力的影響

分別取用DMEM、M199 和L-15 培養基培養的P3代草魚肌纖維，以2.0×106/mL 濃度接種于96 孔板，每孔150 μL。用無血清培養基設置對照組。各處理細胞放入5%CO2，28 ℃的恒溫培養箱培養48 h后，吸出培養液，采用MTT 法檢測細胞活力。

1.4 數據分析

實驗數據均用平均值±標準差（mean±SD）來表示。實驗數據在Excel 2019 中初步處理后，采用SPSS 25.0 對實驗數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA）判定處理的效果，若組間有顯著性差異，再進行Duncan’s 多重比較。P<0.05 被認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 草魚肌肉細胞原代培養形態學及傳代后的形態學觀察

用DMEM和M-199 培養6 d 后，組織塊周圍逐漸有細胞遷移出來，遷出細胞貼壁生長良好，透明折光性好，細胞多呈上皮樣、少數呈不規則星形，上皮樣細胞的分裂速度較快，生長迅速；培養至10 d后，貼壁細胞開始逐漸向周圍呈放射狀增大鋪開，形成生長暈，邊緣細胞排列疏密大小不等；培養至14 d 后，肌纖維細胞開始形成比較均一的細胞群落，細胞形態明顯變細長，貼壁細胞基本鋪滿培養瓶底；培養至22 d 后，離組織塊近的區域比邊遠區域細胞生長密集，使得不同區域單層細胞的密度顯著不同，少數細胞因發生接觸抑制而凋亡。而L-15組在培養6 d 后，未見細胞從組織塊邊緣遷出；在10 d 后，組織塊邊緣遷出比DMEM 和L-15 中貼壁細胞透明的細胞，貼壁細胞不及DMEM 和L-15 培養基明顯，細胞長勢緩慢；培養22 d 后，肌纖維才形成比較均一的細胞群落（圖1）。

圖1 草魚肌肉組織塊細胞在不同培養基中肌細胞的生長情況（×4）Fig.1 The growth of muscle cells of grass carp in different media

圖2 為肌纖維在經過第一次傳代后在不同培養基中的生長情況，傳代后培養3 天的細胞大部分貼壁生長，部分細胞死亡懸浮在培養液里面。細胞形態為主要呈上皮樣。

圖2 草魚肌肉組織塊細胞首次傳代后在不同培養基中的生長情況（×4）Fig.2 The growth of muscle cells of grass carp muscle in different media after the first passage

2.2 不同培養基對草魚肌纖維遷出時間和第一次傳代時間的影響

M199 原代培養的草魚肌肉組織開始遷出細胞的耗時最短，平均時間為（4.00±0.82）d，其次為DMEM組的（5.50±0.58）d，而L-15 組耗時最長，平均為（10.00±1.83）d（P<0.05）。同時，不同培養基對第一次傳代時間的影響結果顯示，M199 培養的草魚肌纖維在（15.50±1.29）d 時達到首次傳代的亞融合狀態（80%～90%），而用DMEM和L-15 培養的草魚肌纖維分別在（24.75±1.50）d 和（30.00±1.83）d 后達到首次傳代的亞融合狀態，且三者之間相互差異顯著（P<0.05，圖3）。

圖3 不同培養基培養對草魚肌纖維遷出時間和達到首次傳代時間的影響Fig.3 Effects of different media on the time of muscle fiber migration and first passage of grass carp

2.3 不同培養基對草魚肌纖維貼壁率的影響

草魚肌纖維在接種2 h、4 h、6 h、8 h 和10 h 后的貼壁率情況如圖4 所示。不同培養基的貼壁率曲線均呈現先快速后逐漸變緩的上升趨勢，均在10 h達到最大值（P<0.05）。對比同一時間節點不同培養基中細胞的貼壁率，可以看出，在各個時間節點M199 和DMEM 的草魚肌纖維貼壁率顯著高于L-15，而除2 h 和6 h 的時間點外，M199 要顯著高于DMEM（P<0.05）。

圖4 不同培養基對草魚肌纖維貼壁率的影響Fig.4 The effect of different media on the adhesion rate of grass carp muscle fibers

2.4 不同培養基對草魚肌纖維生長的影響

由圖5 可見，DMEM、M199 和L-15 培養的P2代草魚肌纖維細胞生長曲線基本都呈S 型，DMEM、M199 和L-15 培養的細胞分別在5 d、3 d、5 d 進入對數生長期，細胞增殖加速，細胞密度快速升高，分別在6 d、5 d、6 d 達到峰值，隨后呈下降趨勢（P<0.05）。不同培養基的細胞擴增數量不同，對比同一培養基不同時間點的細胞密度，在進入第4 d 以后，均以L-15 培養的最低，M199 最高，DMEM居中（P<0.05）。

圖5 草魚肌纖維在不同培養基中的生長曲線Fig.5 Growth curve of grass carp muscle fibers

如圖6 所示，M-199 和DMEM培養的草魚肌纖維72 h 平均擴增倍數分別為（20.58±4.67）和（18.66±4.33），二者差異不顯著，但均顯著高于L-15 組的（8.19±4.17，P<0.05）。

圖6 不同培養基培養對草魚肌纖維增殖的影響Fig.6 The effect of different media on the proliferation of grass carp muscle fibers

2.5 不同培養基培養對細胞活力的影響

不同培養基在培養草魚肌纖維72 h 后的細胞活力結果顯示，M199 培養的草魚肌纖維平均OD 值為（1.03±0.17，P<0.05），顯著高于DMEM 和L-15的平均OD 值（0.06±0.02）和（0.05±0.02）（P<0.05），而后兩者吸光度值沒有明顯區別（圖7）。

圖7 不同培養基培養對細胞活力的影響Fig.7 The effect of different culture media cultures on cell viability

3 討論

用于魚類細胞原代培養的方法主要有酶消化法和組織塊法。組織塊法簡單、高效、便捷，適合于各種組織細胞的原代培養。組織塊給細胞提供了適宜的生存環境，使遷出的細胞更容易貼壁和生長[13]，與酶消化法相比，組織塊法培養的細胞具有更高的增殖速率和細胞活力[14]。這得益于組織塊培養的細胞減少了機械分離所帶來的損害，沒有離開穩定的生長環境，較好地保存了細胞的完整性[15]，且組織塊可以釋放促進細胞增殖和生長的生長因子和細胞因子到培養液中刺激細胞生長[16]。但組織塊培養存在培養周期長、培養液的浮力容易使部分組織塊浮起而致細胞活力喪失等不足[17]。此外，組織塊剪切的大小以及組織塊之間的間距也會對培養效果造成較大影響[18]。

在細胞體外培養的諸多影響因素中，培養基是最直接的影響因素，對細胞生長狀態和增殖潛力都有明顯影響，因此，尋求適合草魚肌纖維體外培養的培養基以在短時間內得到細胞形態好、數量較多的草魚肌纖維用于草魚營養生理，肌肉品質等的研究就顯得異常關鍵。實驗表明，DMEM（高糖）、M199和L-15 三種培養基均能夠促進草魚肌纖維的貼壁和生長增殖，但不同培養基中的草魚肌纖維細胞形態、細胞開始遷出時間、第一次傳代時間、細胞增殖速度、貼壁率以及細胞活力等方面都存在差異。其中M199 促進草魚肌纖維貼壁以及生長增殖的效果最好，表現在較高的細胞貼壁率、細胞擴增倍數以及OD 值。譚風霞[19]在胭脂魚肌肉細胞原代培養中發現M199 和L-15 中的肌肉細胞培養效果最好，且兩者細胞培養效果沒有明顯差異；祝冬梅[20]發現，相比 于L-15、DMEM-F12、MEM 和RPMI-1640 四種培養基，團頭魴肌肉細胞在M199 中增殖速度最快，培養效果最好；而付思思等[21]用L-15 原代培養錦鯉肌肉組織15 d 后，肌肉細胞才開始從組織塊中遷移出來，這與本實驗結果類似，可以看出L-15 并不是魚類肌肉細胞的首選培養基；焦健剛[26]發現，草魚肌肉細胞在20%FBS 的DMEM 高糖培養基中正常貼壁，增殖適中，通過提高DMEM 高糖培養基中FBS 的濃度，細胞的增殖速度會相應提高。本實驗發現在含20%FBS 的M199、DMEM和L-15 三種培養基中，草魚肌肉細胞的原代培養在M199 培養基中增殖速度快，可以縮短草魚肌肉細胞原代培養時間。

細胞培養需要足夠的維生素和氨基酸等營養成分以滿足細胞生長需求。氨基酸作為蛋白質的構件分子，在細胞培養中是不可缺少的成分。氨基酸的缺乏會造成蛋白質的合成受阻，進而影響到這些蛋白質所承載的生理功能，對細胞的狀態，細胞高密度的維持，以及蛋白產量等方面都產生重要影響。而維生素是一類維持細胞生長增殖的生物活性物質，在細胞代謝方面有重要作用[22]，如在細胞中形成酶的輔酶或輔基，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進行。血清是氨基酸和維生素等營養物質的重要來源，但是許多合成培養基中添加了各種氨基酸和維生素以適合更多的細胞系生長。相比于DMEM 和L-15 培養基，M199 培養基中添加了更多種類的氨基酸和維生素，含有22 種氨基酸和17 種維生素。據有關研究表明，氨基酸和維生素品類豐富的培養基更加有利于細胞生長[23]。

培養中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。對于單糖而言，細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低，但培養基高濃度的葡萄糖添加會對細胞生長產生影響。高濃度葡萄糖代謝會產生較多對細胞有毒性的酸性的代謝產物，這些代謝產物降低了營養物質的代謝效率，降低培養基pH，破壞細胞生存環境，從而抑制了細胞的生長[24]。而較低濃度的葡萄糖在提供給細胞充足能量的同時又減少了酸性代謝產物的產生，有利于細胞的生長增殖，減少細胞的凋亡[25]。焦健剛[26]在進行草魚肌肉組織的原代培養時發現，DMEM高糖培養基不利于草魚肌肉細胞的生長，而草魚肌肉細胞在低糖乃至無糖的DMEM中可以較好生長。L-15 用半乳糖替代葡萄糖作為碳源，可以有效減少培養液中乳酸累積的濃度，維持細胞正常生長的生理pH,有利于細胞生長。但是在用半乳糖作為替代碳源的情況下，會對細胞產物的表達和糖基化修飾造成不利影響，這可能與細胞內能量供應不足以及細胞代謝產生較高濃度的氨有關[27]。本實驗中M199、DMEM培養基中的葡萄糖質量濃度分別為1 000 mg/L 和4 500 mg/L，而L-15 用半乳糖替代葡萄糖，這可能是造成細胞生長分化能力在不同培養基中出現較大差異的原因之一。

綜上所述，培養基是細胞體外培養的重要生長環境，本實驗表明，相比于DMEM和L-15，M199 對于草魚肌纖維的生長具有更好的促進作用，是比較適合草魚肌纖維的原代培養的培養基。