益氣活血方對前列腺增殖模型大鼠其作用機理及Bax基因表達的影響

阮 明，肖友平，黃從軍，范 凱，婁 強

（貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550003）

在中老年男性中經常因為前列腺增生導致排尿功能障礙，其臨床癥狀包括尿頻、尿急、排尿不暢，甚至發生尿潴留等，上述這些癥狀常常對患者的生活質量造成嚴重的影響，那么如何改善患者的臨床癥狀，提升患者的生活質量，是目前研究的熱點之一，α 受體阻滯劑和5α 還原酶抑制劑是治療前列腺增生的一線用藥，但二者皆存在治療效果有限，且有一定副作用的不足[1]。中藥性質溫和、靶點廣泛、副作用小，而中藥復方具有多組分協同、系統調控的特點[2]，已被越來越多的患者所認可及接受，然而其成分復雜，作用機制尚不清楚。本課題的研究旨在通過動物實驗的方式，觀察益氣活血方對前列腺增生模型大鼠前列腺增生組織中Bax 基因表達的影響，探究其治療良性前列腺增生的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD 大鼠90 只，10～12 周齡，體重在180～220g 之間，由中國人民解放軍陸軍軍醫大學提供，許可證號：SCXK-（軍）2012-0011，本實驗獲得貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，倫理批準號：KY2019098，符合中國倫理委員會指導原則。實驗開始前先進行適應性喂養1 周。在養殖期間，確保室內溫度在22～26℃之間，空氣濕度保持在40% ～60% 之間，并提供為期12 小時的光照時間，實驗動物可以自由進食和飲水。

1.2 主要藥物及試劑

丙 酸 睪 酮 注 射 液（ 規 格1mL、25mg 批 號：100602）由上海通用醫藥股份有限公司提供；非那雄胺片（規格5mg/ 片批號：II021224）由杭州默沙東制藥有限公司提供；益氣活血中藥顆粒劑由貴州中醫藥大學第二附屬醫院顆粒藥房提供，中藥藥物組成（黃芪30g、桃仁20g、桂枝15g、茯苓15g、丹皮15g、川牛膝15g、荔枝核10g、肉桂6g），共126g，每126g 生藥制成顆粒劑后重量為10.29g。

1.3 主要實驗材料與儀器

HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20180622）、BAX 試劑盒（福州邁新生物科技有限 公 司， 批 號MAB02-54）、OLYMPUS 生 物 顯 微鏡（北京瑞科中意科技有限公司，DXS1000）、電子分析天平（上海贊維衡器有限公司，ZA120R4）、帆船牌載玻片（北京盛坤海利科技發展有限公司，25.4mm×76.2mm），組織包埋盒、（江蘇世泰實驗設備有限公司，31050102W）。

1.4 實驗方法

（1）分組與造模：前列腺增生模型大鼠的造模方式參照已發表文獻[3]，對90 只健康、雄性性成熟的SD 鼠進行隨機數字表法分組，其中空白組15 只，實驗組75 只，空白組每只大鼠每天用2mL 橄欖油皮下注射，實驗組大鼠每天皮下注射丙酸睪酮（5mg/kg，溶2mL 橄欖油），連續給藥28 天。

（2）干預方法：造模完成后，采用隨機數字表法將實驗組的75 只前列腺增生模型大鼠分為模型組、非那雄胺組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組5 個組，其中空白組和模型組大鼠接受的是每天5mL 的生理鹽水灌胃，而非那雄胺組實驗動物給予8mg/kg 的非那雄胺灌胃每天一次（溶解于5mL 的生理鹽水之中）。對中藥低、中、高劑量組大鼠分別給予中藥0.85g/kg、1.7g/kg、2.55g/kg，使其溶于5mL生理鹽水，連服28 天。

（3）觀察指標：連續給藥28 天后，大鼠禁食24h 后，脫頸處死，重新稱重，迅速打開腹腔取出前列腺，將周圍多余組織剔除，表面的水分用吸水紙吸干即可，每一組大鼠的前列腺組織進行HE 染色，觀察其組織病理形態，利用免疫組化技術，測定每組大鼠前列腺組織內Bax 蛋白的表達程度。

前列腺組織HE 染色：先取前列腺組織的一部分切片，浸泡在蒸餾水中一段時間，再用蘇木素水溶液浸染幾分鐘，最后用酸水和氨水進行顏色分離。將試樣水洗1h 后，再放入蒸餾水中浸泡數秒，再用70%和90% 的乙醇各脫水10min，接下來對樣品進行酒精伊紅染色處理，時間為2～3min，然后再進行漸變乙醇脫水，二甲苯（Dialene）透明處理，將材料周圍多余的液體清除，加入適量的中性樹膠，蓋玻片覆蓋，最后在生物顯微鏡下觀察其前列腺組織的病理形態。

免疫組化法檢測Bax 蛋白表達：用4% 以上的多聚甲醛溶液固定剩余前列腺組織20h，再經過脫水處理，用石蠟包裹埋藏，最終組織切片，遵照檢測試劑盒的說明，在清洗樣品的過程中加入抗磷酸鹽緩沖液（PBS），再加入二抗體，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，后復染蘇木素，二甲苯透明后中性樹膠封片，生物顯微鏡下觀察其陽性情況（見圖1），Bax 的陽性顆粒通常在前列腺上皮細胞的細胞質中表達，陽性顆粒通常呈黃色或棕黃色。我們采用IMAGE 技術，結合J 圖像分析軟件，對每組大鼠的Bax 蛋白質進行平均光密度檢測。

圖1 益氣活血中藥對模型大鼠前列腺組織病理形態學的影響（HE，×400）

圖2 各組前列腺組織中Bax 蛋白的表達情況(×400）

（4）統計方法：本研究所采用的統計方法是利用SPSS23.0 軟件進行數據分析，獲取有關統計信息。對于測量資料，若符合正態分布，則采用單因素方差分析；如果不符合正態分布，則采用非參數檢驗分析，P＜0.05 則提示有統計學意義。

2 結果

2.1 益氣活血方對前列腺增生模型大鼠前列腺組織病理的影響

由圖1 可見，空白組前列腺腺體及細胞排列整齊有序，呈大小一致的單層矮柱狀，在顯微鏡下觀察腺腔內未見擴張，腺體內腺上皮細胞向腺腔突出、排列緊密有序、表面光滑、未見明顯分泌物。核內核仁呈暗色，著色較深；模型組前列腺腺體緊密聚積，腺腔擴張，腺體上皮細胞向內突出呈乳頭狀或鋸齒狀，表現為復層或假復層排列，間質和小血管水腫，同時分泌物增多；中藥治療組光鏡可見腺體增生不明顯，腺體排列較整齊，小部分腺體細胞腺腔變大，但腺腔基本光滑，腺上皮細胞大多呈單層柱狀排列，僅有少量腺上皮細胞突入腔內，間質和血管擴張充血水腫較輕。

2.2 益氣活血方對前列腺增殖模型大鼠前列腺Bax 蛋白的影響

模型組Bax 和空白組相比較（P＜0.05），說明本實驗成功復制了前列腺增生模型，同時模型組Bax光密度值明顯低于空白組，說明在前列腺增生時Bax作為細胞凋亡促進基因很難發揮其作用。非那雄胺組及中藥高劑量組其Bax 平均灰度值與模型組相比較（P＜0.05），中藥高劑量組與非那雄胺組相比較說明兩藥效果相當（見表1）。

表1 各實驗組前列腺組織中Bax 蛋白的表達水平（± s)

表1 各實驗組前列腺組織中Bax 蛋白的表達水平（± s)

注：* 與空白組比較P ＜0.05 ；Δ 與前列腺增生模型組比較P ＜0.05 ：# 與非那雄胺組比較P ＜0.05。

組別 數量（n） 光密度值（IU）空白組 15 0.2113±0.02355前列腺增生模型組 15 0.1115±0.00644*非那雄胺組 15 0.1770±0.00795*Δ中藥低劑量組 15 0.1277±0.00444*Δ#中藥中劑量組 15 0.1301±0.00802*Δ#中藥高劑量組 15 0.1756±0.00846*Δ

3 討論

前列腺增生屬于中醫“癃閉”“精癃”范疇，早在2000 年前的《黃帝內經》就有關于“癃閉”的論述，后世醫家不斷總結，提出“小便不暢，點滴短少，病情較緩者為癃；排尿困難，點滴不通，病情較急者為閉”。中醫學指出，癃閉的病因在于腎氣虧虛，導致膀胱氣化失司，同時還伴隨著血瘀、濕熱、氣滯等病理因素[4-5]。隨著現代醫學家對該疾病的認知逐漸加深，他們更加強調了“精氣奪則虛”的觀點，即腎虛血瘀是導致該疾病發生的根本原因。因此，益氣利水、活血化瘀是治療癃閉的基本方法，通過疏通積聚、通暢水道，可以使癃閉的臨床癥狀得到很大的緩解[6]。采用益氣活血、清熱利濕的療法，可有效降低前列腺指數，從而促進增生的前列腺萎縮[7]，同時還可以改善患者排尿困難等癥狀。桂枝茯苓丸出自《金匱要略·婦女妊娠病脈證并治》，起初用來治療婦女宿有血塊、瘀血經閉、月經腹痛、產后惡露不暢等癥，能活血、化瘀、消腫。近年來，大量的臨床研究表明，桂枝茯苓丸在治療良性前列腺增生方面具有顯著的療效[8-10]，貴州中醫藥大學第二附屬醫院泌尿外科長期從事前列腺增生的研究工作，并在桂枝茯苓丸原方的基礎上進行加減，從而形成自己的協定方，命名為“益氣活血方”。近年來，細胞凋亡的研究在前列腺增生癥的發病過程中逐步深入，Bax 蛋白、Caspase-3 酶和Bcl-2 蛋白在細胞凋亡過程中的不平衡相互作用是一個非常重要的因素[11]，這些因素參與了增殖分化期的調節與控制，而最終導致細胞死亡或壞死。Bax 和Bcl-2 的表達動態平衡對于維持前列腺組織形態的正常，以及在前列腺增生的發生、發展和預后方面扮演著至關重要的角色[12]。在前列腺增生的過程中，Bax基因的表達水平顯著降低，這是由于其在促進細胞凋亡方面的作用受到了抑制。在本次實驗中，模型組的Bax 表達水平顯著低于其他組，這表明Bax 基因在促進前列腺腺體增生時的細胞凋亡作用明顯減弱。在正常組織中，Bax 基因的表達量顯著高于其他組，這表明只有當Bax 的表達量達到較高水平時，才能維持組織細胞的正常新陳代謝。通過治療后非那雄胺組、中藥高劑量組和模型組相比較，其Bax 表達水平明顯升高，說明非那雄胺及益氣活血方均能增加Bax 的表達，促進前列腺細胞的凋亡，抑制前列腺腺體增殖，進而對前列腺增生起到治療作用。

綜上所述，本研究以益氣活血為法則，遴選出黃芪、桃仁、桂枝等8 味中藥對前列腺增生模型大鼠進行治療，并從組織病理形態，以及對Bax 基因表達等方面進行研究，證實了益氣活血中藥對前列腺增生具有良好的治療作用。同時也進一步證實細胞凋亡在前列腺增生的發病過程中起著重要的作用，益氣活血法對前列腺增生的治療是通過調節凋亡抑制基因及凋亡促進基因的表達從而發揮其治療作用的，為中藥治療前列腺增生提供了新的依據。