龜鹿二仙膠治療阿爾茨海默病研究進展及其抗氧化應激的網(wǎng)絡藥理學分析*

何蕾，郭錦晨，韓輝，宋宇琪，夏澤華，李子龍

1 安徽中醫(yī)藥大學 安徽合肥 230038

2 新安醫(yī)學教育部重點實驗室 安徽合肥 230038

3 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱老年性癡呆，以認知功能惡化和行為改變?yōu)橹饕R床特征的神經(jīng)退行性疾病，影響全球近5000 多萬人，是導致死亡的第五大原因[1]。目前治療AD 的策略集中在緩解癥狀上，常以膽堿能和谷氨酸能神經(jīng)傳遞為靶向改善癥狀，但無法解決神經(jīng)退化的根本問題[2]。隨著人口老齡化的深入，AD 的潛在患者愈發(fā)增多，給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔[3]，因此尋找行之有效并且相對價廉的治療方法迫在眉睫[4]。研究顯示，中醫(yī)藥在治療AD 上具有一定優(yōu)勢，且不良反應少[5]。補腎生髓法是中醫(yī)治療AD 的經(jīng)典治法之一，龜鹿二仙膠作為補腎生髓法的代表方劑，可以有效改善AD 的癥狀，但由于龜鹿二仙膠成分較復雜，其治療AD 的具體作用機制仍缺乏有力證據(jù)證明。而隨著AD 機制研究的深入，越來越多證據(jù)顯示氧化應激是AD 形成與發(fā)展的重要機制之一，然筆者在綜述龜鹿二仙膠治療AD 的進展情況時尚未發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠改善AD 氧化應激指標及影響相關蛋白表達等研究。網(wǎng)絡藥理學與中醫(yī)整體觀念具有共通性，可以預測草藥中存在的化合物的多個靶點與特定疾病相關的多個基因之間的相互作用，是研究中藥藥理的方法之一[6]。分子對接可以通過評估網(wǎng)絡中組分與靶點的結合能來揭示網(wǎng)絡中組分與靶點之間的相互作用，提高網(wǎng)絡的準確性[7]。筆者試用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術分析龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的機制，以期為未來研究龜鹿二仙膠治療AD 的作用機制提供參考。

龜鹿二仙膠治療AD 的研究進展

1 補腎生髓法治療AD 的中樞機制研究概況

中醫(yī)學認為腎虛是AD 發(fā)病的重要原因[8]，人體腦部思維活動及意識形態(tài)等皆可能與腎精關系密切[9]，正如唐容川《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義·五臟所藏》所言：“事物之所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎精”。《靈樞·海論》指出“腦為髓之海”，惟有髓海充足時腦絡才能得到充分滋養(yǎng)。補腎生髓法是中醫(yī)治療AD 的經(jīng)典治法之一，腎為先天之本，可藏精生髓，而髓由精化，故腎精充盈，則腦髓充滿，髓生則益腦充腦，從而達到改善AD 癥狀的作用。研究發(fā)現(xiàn)，補腎生髓法治療AD的作用機制包括通過各種信號通路調節(jié)突觸蛋白的表達[10-11]、減弱神經(jīng)炎性反應[12]、抗氧化應激[13-14]、營養(yǎng)大腦神經(jīng)、改善大腦代謝[15]以及改善腦部血液循環(huán)[16-18]。從現(xiàn)代藥理學、生物學等角度詮釋了“腎生髓，腦為髓海”的中醫(yī)理論。

2 龜鹿二仙膠治療AD 的藥理作用研究進展

補腎生髓法的代表方劑龜鹿二仙膠出自于明代王三才的《醫(yī)便》，由龜板膠、鹿角膠、枸杞子、人參4味中藥組成，方中以血肉有情之品龜板膠及鹿角膠陰陽雙補并為君藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)二膠含有大量蛋白質、多種氨基酸以及各種微量元素等多種化學成分，具有顯著補腦、調節(jié)代謝、延緩衰老等多重作用[19-20]，配合人參、枸杞子益氣養(yǎng)陰，健脾補血，助君藥滋補肝腎精血。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參具有抗衰老[21-22]、益智[23-24]、增強學習記憶能力[25-26]等作用，可通過影響突觸功能可塑性及神經(jīng)發(fā)生、β 淀粉樣蛋白水平、線粒體功能及氧化應激、Tau 蛋白神經(jīng)毒纏結、神經(jīng)炎癥過程等多個途徑減輕AD 患者癥狀[27]；枸杞具有抗氧化[28-29]、抗衰老[30-31]、神經(jīng)保護[32-33]等作用，其提取物可顯著降低皮層神經(jīng)元中Aβ 寡聚體水平及Aβ 誘導的神經(jīng)毒性，從而改善AD 程度[34]。

龜鹿二仙膠具有補血、抗疲勞、抗氧化、抗衰老、增強免疫、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用，能夠改善AD 患者炎癥指標、腦部血液循環(huán)[16-18]。此外，在治療其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中龜鹿二仙膠亦顯示出良好效果，如其可改善帕金森病患者睡眠質量[35-36]；通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能，龜鹿二仙膠可調節(jié)創(chuàng)傷后應激障礙模型大鼠的行為學異常[37-38]。

3 龜鹿二仙膠治療AD 的臨床實驗研究情況

研究表明[39-41]，龜鹿二仙膠與常規(guī)西藥相比對AD 癥狀改善更加顯著。然而關于其作用機制的研究較少，目前主要從改善腦血流、消除Aβ 沉積和tau 蛋白入手。

經(jīng) 顱 多 普 勒 超 聲（Transcranial Doppler Ultrasound，TCD）作為一種新型超聲檢查技術，可以直接獲得患者血流速度、阻力等血流動力學指標，故可用于監(jiān)測AD 腦血液循環(huán)[42]。馬俊杰團隊[16]引入TCD 監(jiān)測龜鹿二仙膠對患者腦部血液循環(huán)的調節(jié)作用，結果顯示該方對腦血管TCD 各參數(shù)指標皆有顯著改善作用，且治療組結果優(yōu)于安理申組，說明龜鹿二仙膠補腎生髓與改善腦部血液循環(huán)之間可能存在邏輯關系。在此基礎上，該團隊運用MRI 進一步觀察龜鹿二仙膠對血管周圍間隙（Perivascular Spaces，PVS）、Virchow-Robin 腔（VRS）數(shù)目及直徑的影響[17-18]。結果顯示運用龜鹿二仙膠治療第31 天無明顯改善，第61 天與治療前及對照組比較PVS、VRS 的數(shù)目無變化，而直徑顯著縮小。PVS 以及VRS 的分布與血管走行一致，可協(xié)助AD 腦部相關代謝產(chǎn)物β-淀粉樣蛋白（Aβ）及Tau 蛋白等的循環(huán)及清除[43]。此外，該團隊發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠亦可改善TNF-α、IL-6及IL-1 等炎性因子水平。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，氧化應激可能是導致認知衰老和AD 的關鍵機制之一[44]。氧化應激可通過促進Aβ 沉積、tau 蛋白過度磷酸化以及突觸和神經(jīng)元的丟失參與了AD 的發(fā)展[45]。改善氧化應激可以明顯改善AD[46]。已有研究顯示補腎生髓法可以改善AD 的氧化應激相關指標[47-48]，但筆者尚未發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激機制的研究，故試從網(wǎng)絡藥理學及分子對接探討其發(fā)生機制，以供臨床進一步研究。

網(wǎng)絡藥理學及分子對接分析

1 龜鹿二仙膠化學成分及相關靶點的獲取及篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php）檢索人參、枸杞子的化學成分，因檢測不到龜板和鹿角膠的化學成分，故于BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、Herb 數(shù)據(jù)庫（http：//herb.ac.cn/）中檢索，并基于口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 進行篩選，但龜板和鹿角膠含有的化合物大多不符合篩選標準，因此結合相關文獻納入數(shù)據(jù)庫未收納的化學成分[49-51]，最終確定其活性成分。將活性成分輸入TCMSP 和Drug Bank 數(shù)據(jù)庫以查詢與之對應的靶標蛋白，再將靶標蛋白輸入UnitProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot. org/）以查詢其對應的基因名稱。共得到96 個化學成分，其中人參22 個，枸杞子45 個，龜板17 個，鹿角12 個。篩去無對應靶點的成分，最終去除重復值后共獲得龜鹿二仙膠67 個潛在的有效成分，靶點79 個。

2 AD 氧化應激靶點篩選

分 別 以“Alzheimer’s disease”“Oxidative stress”為關鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）收集相關靶點并取交集，得到AD 氧化應激的相關靶標信息。結果發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病及氧化應激靶點在Genecards 數(shù)據(jù)庫中分別找到相關靶點11501、9629 個。將AD 氧化應激的靶點導入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）作圖，共有交集靶點6100 個，見圖1。

圖1 AD 與氧化應激共同靶點Venn 圖

3 龜鹿二仙膠-AD 氧化應激的靶點網(wǎng)絡構建及可視化

利用Venny2.1.0 導入AD 與氧化應激的交集，再導入龜鹿二仙膠相關靶點，得到疾病與藥材共有靶點。使用Cytoscape3.9.1 軟件進行龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的“活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡可視化分析。疾病與藥材交集68 個，見圖2。將成分-靶點、疾病-靶點關系表導入Cytoscape3.9.1 中，選出核心靶點構建成分-交集靶點-疾病網(wǎng)絡，見圖3。

圖2 龜鹿二仙膠與AD 氧化應激共同靶點Venn 圖

圖3 龜鹿二仙膠有效成分與AD 氧化應激的成分-靶點網(wǎng)絡圖

3.1 龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的蛋白互作PPI網(wǎng)絡的構建 在String 在線平臺數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）上傳2.1.3 篩選得到的藥物與疾病的交集靶點，在項目欄中選擇研究物種為“Homo sapiens”，設置交互得分＞0.4，其余參數(shù)均保持默認，進行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并導出PPI 網(wǎng)絡（見圖4）及TSV 文件。運用Cytoscape軟件中的CytoNCA 插件從導入的TSV 文件中利用Degree 大小篩選龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的關鍵靶蛋白，篩選過程及結果見圖4，度值最高的主要包括IL6、PPARG、CASP3、ESR1、RELA 等。

圖4 龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的PPI 網(wǎng)絡

3.2 龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的PPI 網(wǎng)絡聚類可視化 將龜鹿二仙膠與AD 的交集靶點導入Cytoscape 軟件，應用MCODE 插件進行聚類分析。結果顯示，龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的相關靶點主要有3 個聚類簇，聚類網(wǎng)絡圖根據(jù)評分的高低分別導出，可視化結果見圖5（A-C）。

圖5 龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的關鍵靶點聚類圖

4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

將龜鹿二仙膠的有效作用靶點上傳至David 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），限定人源，通過基因功能（gene ontology，GO）分析結果獲取靶點主要作用過程信息。最終得到GO 條目304 條，包括生物過程（biological process，BP）203 條，細胞組成（cellular component，CC）43 條，分子功能（molecular function，MF）58 條，生物過程中排名靠前的有細胞內類固醇激素受體信號通路、乙醇反應、藥物反應等；細胞組成分析中靠前的主要是突觸前膜的組成成分、線粒體、突觸后膜的組成成分、軸突末端等；分子功能分析靠前的主要是RNA 聚合酶II 轉錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA 結合、類固醇結合、酶結合等。將BP、CC、MF 排名前10 的條目導入微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）獲得GO 富集分析柱狀圖，見圖6。

圖6 龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的GO 富集分析柱狀圖

同樣在David 數(shù)據(jù)庫中90 條獲取KEGG 通路信息，富集分析結果比較靠前的主要是脂質和動脈粥樣硬化、化學致癌作用-受體活化、癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路等。將富集結果導入微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/），對排名前20 位的結果繪制氣泡圖（見圖7）。

5 活性成分與關鍵靶點的分子對接分析

使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取龜鹿二仙膠活性成分的2D 結構，利用AutoDock Tools 1.5.7 軟件優(yōu)化小分子結構、添加極性氫原子，使其還原為最低能量形式，更貼近對接時的狀態(tài)。使用RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）獲取關鍵靶點的三維結構，應用PyMOL 2.3.0 軟件對關鍵靶點進行預處理，包括去除水分子和原有配體。應用AutoDock Vina 1.2.0 軟件將處理好的成分配體與靶點蛋白進行分子對接操作，最后對對接結果進行可視化分析（圖8）。

圖8 龜鹿二仙膠核心成分與疾病關鍵靶點的分子對接示意圖

選取網(wǎng)絡圖中度值排名靠前的3 個核心靶點IL6、PPARG、CASP3 以及排名前三的小分子山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇，結合能均＜-5.0（見表1）。

表1 核心靶點與主要成分的結合能

討 論

本文綜述了龜鹿二仙膠治療AD 的研究進展，發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠的藥理研究和臨床應用較少，在治療AD 上目前主要研究了其腦代謝與腦血流機制。氧化應激途徑是AD 的重要發(fā)病機制之一，已有實驗表明補腎生髓法可以改善AD 患者氧化應激指標，然而尚未有補腎生髓代表方龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的相關研究。故本研究利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術探究其干預AD 氧化應激的具體作用機制。

研究結果顯示，龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的核心化學成分包括山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇，這與目前有關研究結果一致。山柰酚具有抗氧化[52]、保護大腦[53]等作用，可降低脂質過氧化和增加腦中的內源性抗氧化酶[54]，可通過抑制細胞凋亡保護腦細胞[55]，調節(jié)TLR4/NF-κB 等通路表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用[56]，誘導細胞自噬發(fā)揮對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用[57]。山奈酚可通過減輕氧化應激和炎癥，降低aβ 誘導的神經(jīng)毒性，調節(jié)膽堿能系統(tǒng)等途徑改善AD認知障礙[58-59]。β-谷甾醇可干擾多種細胞信號通路，包括細胞周期、凋亡、增殖、抗氧化、血管生成等，且無明顯毒性[60]。Ayaz 等人[61]對β-谷甾醇進行了體外、體內、行為和分子對接研究，研究顯示，β-谷甾醇具有強大的抗膽堿酯酶和抗氧化潛能，能充分到達大腦并抑制參與膽堿酯酶代謝的酶，并起到自由基清除劑的作用，而在SWM、y-迷宮和平衡木測試中發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以改善認知缺陷，短期記憶和運動障礙，可用于治療AD 記憶缺陷障礙。豆甾醇具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、保護精神狀況等作用[62]，Yadav 等人[63]對氯胺酮誘導的小鼠精神病模型進行行為學研究及生化檢測，結果發(fā)現(xiàn)豆甾醇可以改善模型小鼠的自發(fā)活動、刻板行為等行為表現(xiàn)，增加γ-氨基丁酸、谷胱甘肽水平，減少多巴胺、丙二醛、TNF-α 水平并降低乙酰膽堿酯酶的活性，顯示了其在治療精神病癥狀方面的潛在作用。

PPI 網(wǎng)絡分析結果顯示IL6、PPARG、CASP3 為PPI 網(wǎng)絡中度值排名前3 的靶點，提示其可能是龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的核心靶點。IL-6 是參與調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)免疫應答和炎性反應的重要細胞因子之一，可促進單核細胞產(chǎn)生多種炎性細胞因子，作用于多種神經(jīng)系統(tǒng)的靶細胞[64]。AD 患者大腦中Aβ 沉積會引起一些免疫分子參與炎性反應，使IL6 等炎性因子水平增加，同時IL-6 的增加也可促進Aβ 的積累，破壞神經(jīng)完整性[65]。此外，IL-6 還可通過影響下游信號通路炎性因子的表達，加劇氧化應激對腦組織的損害，導致神經(jīng)元萎縮凋亡[66]。PPARG 主要在脂肪、肌肉以及神經(jīng)系統(tǒng)中表達，可調控與脂肪代謝相關的轉運蛋白和脂肪酶的表達[67]，介導抗血管生成過程[68]，在控制炎癥、改善動脈粥樣硬化和調節(jié)免疫過程中發(fā)揮重要作用[69]。研究顯示[70]，PPARG 激動劑可改善AD 動物模型的認知行為，可能是治療AD 的一種有潛力的方法。CASP3 為細胞凋亡途徑中最關鍵的酶，大量研究證實CASP3 介導的淀粉樣前體蛋白切割是AD中淀粉樣變和神經(jīng)元細胞死亡的潛在機制[71]。

本研究從網(wǎng)絡藥理學及分子對接的角度闡釋了龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激的機制是多成分-多通路-多靶點的網(wǎng)狀復合協(xié)同作用的結果，而得出的核心成分、靶點及通路為進一步探討其發(fā)揮效用的活性成分的物質基礎和具體作用機制研究提供了方向，后續(xù)尚需系統(tǒng)的體內外實驗以及具體的靶點驗證進一步證實龜鹿二仙膠干預AD 氧化應激作用的網(wǎng)狀內在聯(lián)系及具體準確的靶向機制。