兩種口蹄疫O 型、A 型抗體檢測試劑盒檢測豬口蹄疫抗體的應用研究

劉利芳，楊思宇，李撒

（鄭州中農快檢科技有限公司 鄭州 451164）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的人畜共患傳染病，是畜間發生于牛、羊、豬等偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播迅速，流行面廣，成年動物多取良性經過，幼齡動物多因心肌受損而死亡率較高。本病廣泛流行于世界各地，由于本病使動物及其產品流通和國際貿易受到限制，造成了巨大的經濟損失，世界動物衛生組織將口蹄疫列為動物A 類傳染病，我國《中華人民共和國動物防疫法》將其列為一類疫病[1]。目前在我國，疫苗免疫是最主要手段。酶聯免疫吸附試驗因在口蹄疫檢測中具有敏感、特異、穩定、安全、快速、簡單易于操作等特點而備受青睞。本研究利用兩種口蹄疫ELISA 檢測試劑盒對血清進行檢測，研究不同試劑盒的應用情況，以期選擇更簡便準確的方法用于大規模檢測，以便做好口蹄疫防治工作，也有利于試劑盒的不斷改進。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣品

1）四份已知中和抗體效價的豬口蹄疫O 型血清，編號N 為9 號、10 號、11 號、17 號。一份已免疫口蹄疫豬只血清，編號N為20 號。血清均由河南豬拱門生物科技有限公司提供。

2）樣品處理：將上述血清分別以2 倍倍比稀釋至1:512，分裝至1.5ml 離心管內，并依次編號為N-1～N-9，含原血清共50 個待檢樣品。

1.1.2 檢測試劑

1）口蹄疫病毒A 型、O 型液相阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒。

2）口蹄疫病毒A 型、O 型抗體固相競爭ELISA 檢測試劑盒。

1.1.3 主要儀器

酶標儀（BioTek ELX808）、移液器（Eppendorf）、電熱恒溫培養箱（精宏DNP-9082）、生化培養箱（精宏SUP-080）。

1.2 檢測方法

1.2.1 固相競爭ELISA 檢測試劑盒檢測：

1）實驗方法主要參考說明書，實驗流程如下：①用ELISA 稀釋液依次1/10 倍稀釋樣本血清、1/10 和1/30 倍稀釋陽性血清；②加樣布局如表1 所示，50 μL/孔依次加入陰性對照、1/10 倍稀釋的樣本血清、1/10 倍和1/30 倍稀釋的陽性對照，室溫孵育1 h；③加酶標記物25 μL/孔，室溫孵育1 h；④1×洗液200 μL/孔，洗板4 次；⑤加底物顯色液50 μL/孔，室溫避光孵育20 min；⑥加終止液50 μL/孔，酶標儀讀取OD450nm值。

表1 口蹄疫病毒A、O型抗體固相競爭ELISA試驗酶標板樣品布局

2）實驗成立條件：A 型陰性對照OD 值≥0.8，O 型陰性對照OD值≥1.0；A 型、O 型陽性對照血清的阻斷率在1/10 稀釋時應≥85%，在1/30 時＞50%。

3）結果判定：阻斷率≥50%時為陽性；阻斷率＜50%時為陰性。

1.2.2 液相阻斷ELISA 檢測試劑盒檢測：

1）實驗流程：①選擇10 份樣品布局操作，使用5 板，加樣布局如表2 所示，A1～A10：75μl 1×PBST+25μl 待檢樣品；A11～A12：50μl 1×PBST+50μl 陽性、陰性對照；B1～12、C1～H11：50μl 1×PBST；2×倍比稀釋（陰性對照只稀釋2 孔）50μl/孔；4 個病毒抗原對照孔加工作濃度病毒抗原100μl/孔，其余各孔加50μl/孔，37℃溫育30min。②1×PBST 270μl/孔，洗板3 次。③加酶標抗體工作液50μl/孔，37℃溫育30min。④1×PBST 270μl/孔，洗板3 次。⑤加混合底物液50μl/孔（TMB 底物A 溶液與B 溶液1:1 混合），37℃溫育15min。⑥加終止液50μl/孔，酶標儀讀取OD450nm值。

表2 口蹄疫病毒A、O型抗體液相阻斷ELISA試驗酶標板樣品布局（板1～板5）

2）實驗成立條件：4 孔病毒抗原對照OD450nm值應在1.0 以上。陽性對照抗體效價應在1:1024±1 滴度以內，陰性對照血清抗體效價應＜1:8。

3）結果判定：抗體效價大于或等于1:128 判為口蹄疫抗體陽性；1:64～1:128 時，判為可疑；小于1:64，判定為陰性。可疑血清樣品，可以重測，重測抗體效價大于或等于1:128，判為陽性，小于1:128 判為陰性。

2 結果與分析

2.1 50 份樣本抗體陽性檢測結果（表3）

表3 50份樣本抗體陽性檢測結果

1）從表3 可以看出血清10 號、11 號和17 號三組，O 型固相競爭ELISA 檢測試劑盒檢測結果陽性數高于O 型液相阻斷，9 號和20 號兩組，O 型液相阻斷ELISA 檢測試劑盒檢測結果陽性數高于O 型固相競爭ELISA 檢測試劑盒，總體來說，兩種O 型試劑盒檢測結果陽性率差別不大。

2）血清9 號、10 號、11 號和17 號四組都是O 型抗體血清（無A 型抗體），A 型固相競爭ELISA 檢測試劑盒檢測結果全為陰性，無假陽性，符合預期，但A 型液相阻斷ELISA 檢測試劑盒檢測的每組均出現了假陽性。相對來說，A 型固相競爭ELISA檢測試劑盒的特異性較好。

2.2 O 型試劑盒檢測結果與中和抗體的線性關系

1）固相競爭ELISA 檢測試劑盒檢測阻斷值與中和抗體的線性關系（圖1）

圖1 固相競爭-FMD-O-ELISA-BR（%）與中和抗體的線性關系

O 型固相競爭ELISA 檢測試劑盒檢測值與中和抗體呈現強線性關系（線性系數R＞0.9）（圖1），證明此O 型固相競爭ELISA 檢測試劑盒是合適的免疫評估試劑盒[2]。

2）液相阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒檢測抗體效價與中和抗體的線性關系

圖2 顯示此口蹄疫O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒在待檢血清稀釋到512 倍處于高抗原、低抗體水平進行檢測時出現鉤狀效應中的后帶現象，這是試劑盒不穩定的一種現象。液相阻斷試劑盒檢測連續被成倍稀釋的血清易得相同的抗體效價值（如1 024、720、360、180 等），檢測結果區別度不高，這也是試劑盒不穩定的外在表現之一。同時，檢測范圍受限，高抗體即超過效價1 024，就無法檢測出來了。

圖2 液相阻斷-FMD-O-ELISA-Titer 與中和抗體的線性關系

3 結論與討論

1）從本次試驗結果發現O 型抗體固相競爭ELISA 檢測試劑盒和O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒的陽性率相差不大；A 型抗體固相競爭ELISA 檢測試劑盒較A 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒特異性強，且A 型抗體固相競爭ELISA 檢測試劑盒檢測值與中和抗體呈現更強線性關系，穩定性較好。

2）實驗結果顯示A 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒在檢測O 型抗體血清時每組均出現假陽性結果，推測O 型液相阻斷試劑盒是否也會存在假陽性，值得進一步驗證。

3）綜合來看，液相阻斷ELISA 檢測試劑盒能測定血清中的具體抗體效價值，但其特異性、穩定性仍需提高，且操作過程涉及血清梯度稀釋步驟煩瑣，對人員實驗技術要求高，同時一板反應板檢測樣品數量少（10 份）成本較高，需測定血清中的具體抗體效價可選擇液相阻斷ELISA 檢測試劑盒。固相競爭ELISA 檢測試劑盒在操作方面同時具有簡便、耗時短的優點，且一板反應板檢測樣品數量90 份，檢測成本低。在實際應用中多數基層檢測是進行口蹄疫抗體定性分析，用于確定口蹄疫抗體水平是否在保護范圍內[3]，因此更推薦基層獸醫實驗室選擇使用固相競爭ELISA 檢測試劑盒。■