一例蛋雞J 亞群禽白血病的診斷

周戈 ，儲濤

（1.嵐皋縣農業農村局畜牧獸醫中心 陜西安康 725400；2.嵐皋縣佐龍鎮農業綜合服務站 陜西安康 725400）

禽白血病病毒（Avian Leukosis Viruses，ALV）是一類主要引起禽類各種造血細胞腫瘤性增生為特征的反轉錄病毒群[1]。該病病毒群根據病毒囊膜糖蛋白的抗原差異性、病毒干擾實驗、宿主范圍和基因組的分子生物學等特征，總共分為10 個亞群，被命名為A 亞群至J 亞群。其中A、B、C、D 亞群為外源性病毒，能夠誘發腫瘤性新生物；E、F、G、H、I 亞群為內源性病毒，沒有致瘤性；J 亞群禽白血病病毒（Subgroup J Avian Leukosis Virus，ALV-J）具有其他亞群的所有特性，同時也表現出自身獨特性，其傳播性和致病性均比其它亞群強。近幾年國內出現的禽白血病感染病例主要以J 亞群病毒感染為主[2]。

禽白血病的傳播方式有兩種，即水平傳播、垂直傳播[3]。水平傳播的途徑是直接接觸。除了直接接觸傳染外；間接方式也可以導致傳染。垂直傳播的途徑是從帶有禽白血病的種雞場引種，從而孵化出的雞苗帶毒。發病蛋雞主要表現為食欲不振、貧血、極度消瘦、產蛋率下降等癥狀；剖檢后可發現極度消瘦，龍骨發育不全，全身性貧血，增生型的特征性肉眼病變是肝、脾、腎呈彌漫性腫大；而且雞胚也發生病變。該病可以抑制機體免疫系統的表達，能引起雞多種具有傳染性的良性和惡性腫瘤，其高死亡率和淘汰率給養雞業造成了巨大的經濟損失。

禽白血病流行主要原因是種雞群凈化不徹底，無法控制傳染源，導致大量流行。筆者在安康嵐皋農業大學動科院實驗室實習期間，參與接診了一起安康嵐皋某雞場蛋雞死亡的病例，經過一系列的檢測，最終確診為ALV-J 感染?，F將基本情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1）發病情況。2021 年9 月，安康嵐皋某雞場12 月齡蛋雞出現食欲不振、精神沉郁、貧血、極度消瘦、產蛋率下降等癥狀，雞場飼養土雞數量約為4 000 羽。該雞群于2021 年9 月12 日開始陸續出現死亡，到9 月16 日為止共計發病400 羽，發病率為4.4%，死亡40 羽，死亡率10%。該雞場蛋雞的飼養方式是散養，免疫程序為常規免疫，采用的飼料為全價飼料。觀察畜主帶過來的飼料樣品，未發現有霉變的情況，求診之前沒有使用過藥物，由此排除了中毒等原因造成蛋雞出現此癥狀的可能性，初步懷疑蛋雞出現此癥狀是傳染病造成的。再結合臨床癥狀和病理剖檢結果，篩選出細菌、禽流感（AIV）、新城疫（NDV）和禽白血病四個可疑病因。

2）臨床癥狀。觀察病雞，可見縮頸，雞冠蒼白皺縮，食欲不振，精神沉郁，極度消瘦，排灰色稀狀糞便。病情嚴重的蛋雞甚至不能站立。

3）儀器與試劑。普通瓊脂培養基、50×TAE 緩沖液、雙蒸水、PBS溶液和75%乙醇為本實驗室制備保存；革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；2×Buffer PCR Master Mix 購于天根生化科技（北京）有限公司；EB（Ethidium bromide，EtBr）、瓊脂糖、氯仿和異丙醇為國產分析純產品。生化培養箱：LRH-25oA 型廣東醫療器械廠；超凈工作臺：SPEGAIRTECH；PCR 儀：Hybaio 公司；冷凍高速離心機：18PR-52 型日本；冷凍臺式離心機：Heitthc 公司產品；紫外分光儀：PE 公司；電泳設備：BIORAD 公司。

1.2 方法

1）細菌的分離與鑒定。細菌分離培養：用接種環取心包積液、肝臟切面接種于普通瓊脂板上，37 ℃恒溫箱中培養12 h。觀察菌落形態。

2）AIV 和NDV 的PCR 檢測。利用實驗室已確定的禽流感和新城疫病毒RT-PCR 檢測方法對采集的病料進行檢測。

病料研磨：無菌條件下采集病雞胰臟、脾臟、肝臟等病料，2～8 ℃保存。取組織混樣約0.5 g，加1 mL 生理鹽水研磨到沒有塊狀的混雜液，然后將樣品轉到1.5 mL 滅菌離心管中，8 000 rpm 離心2 min，取100 μL 的上清液至1.5 mL 滅菌離心管當中。

總RNA 提取：利用Trizol 法提取細胞總RNA。

①病料組織中加2～3 mLPBS 研磨，凍融三次8 000 r/min 離心3 min；②取上清液200 μL 樣品+1 mL Trizol 酶4 ℃裂解10～20 min；③加200 μL 氯仿，充分振蕩，12 000 r/min 離心10 min；④取上清液400 μL ，加等量的異丙醇，手動上下顛倒混勻，4 ℃靜置10～20 min；⑤12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入750 μL 75%乙醇，手動上下顛倒混勻；⑥12 000 r/min 離心10 min；⑦棄上清液，倒置在濾紙上，吹干5 min，加10 μL ddH2O。

反轉錄：用上述提取的總RNA 為模板，用OligaodT 引物進行反轉錄。具體步驟按照TaKaRa 公司反轉錄體系（見表1）說明書按如下進行。

表1 反轉錄體系

AIV 和NDV 引物的設計與合成：根據AIV 和NDV 的保守片段，同時采用Primer Express 5.0 軟件，設計了擴增片段為453 bp 的AIV 的一對引物，擴增片段為421 bp 的NDV 的一對引物，由TaKaRa 公司合成，引物序列如下：

AIV：P1:5’-ATGAGTCTTCTTCCGAGGTCA-3’；P2:5’-ACTCCA GCTCGTGTTGACAAT-3’

NDV：P1:5’-TTATAGTTAGTTTACCTGTCT-3’；P2:5’-GTAGTT TTTTCTTAAATCTTC -3’

AIV 和NDV 的PCR 擴增（見表2）：

表2 AIV和NDV的PCR體系

AIV 的PCR 反應體系：反應程序為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35 個循環；最后72 ℃延伸10 min；PCR 產物4 ℃保存。

NDV 的PCR 反應體系：反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，共30 個循環；最后72 ℃延伸10 min；PCR 產物4 ℃保存。

PCR 擴增產物分析：稱取0.3 g 瓊脂糖加入30 mL TAE 緩沖液，搖勻，微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，將制膠板放入制膠槽中，插入合適的梳子，將溶解的瓊脂糖TAE 緩沖液加入2 μL EB 后，混合均勻，倒入其中，直至厚度達4～6 mm，在室溫下冷卻凝固。將AIV的PCR 和NDV 的PCR 反應產物以及DL 600 Marker 在100 V 電壓下電泳30 min 后在凝膠成像系統下觀察電泳結果并進行分析。

3）ALV-J 的PCR 檢測。從病雞中提取病料后進行PCR 檢測。根據ALV-J 原始毒株HPRS-103 的基因組DNA-gp85 基因中的一段序列設計引物。引物序列如下：

P1:5’-CCCAAGCTTGGAGTTCATCTGTTGCGA-3’

P2:5’-CGCGGATCCGCGCCTGCTACGGCGGT-3’

ALV-J 的PCR 擴增（見表3）：

表3 ALV-J的PCR反應體系

ALV-J 的PCR 反應體系：反應程序為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35 個循環；最后72 ℃延伸10 min。

PCR 擴增產物分析：稱取0.3 g 瓊脂糖加入30 mL TAE 緩沖液，搖勻，微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，將制膠板放入制膠槽中，插入合適的梳子，將溶解的瓊脂糖TAE 緩沖液加入2 μL EB 后，混合均勻，倒入其中，直至厚度達4～6 mm，在室溫下冷卻凝固。將ALV-J 的PCR 反應產物以及DL 2000 Marker 在100 V 電壓下電泳30 min 后在凝膠成像系統下觀察電泳結果并進行分析。預期擴增目的片段為968 bp。

2 結果

2.1 病理變化

對病死雞進行解剖，可見極度消瘦，龍骨發育不全，全身性貧血，主要病變情況有肝臟腫脹、脾臟腫脹、心冠狀脂肪消失、心臟腫瘤、肌肉腫瘤、腎臟腫瘤、肌胃腫瘤。

觀察畜主帶來的飼料樣品，沒有發現其他可導致雞出現此類情況的物質，并且在此之前并沒有進行藥物治療，所以初步懷疑是傳染病。

2.2 病因初步分析

根據臨床檢查與詢問得知，飼養規模約為9 000 羽，共計發病400 羽，發病率4.4%，死亡40 羽，死亡率10%。觀察畜主帶過來的飼料樣品，沒發現有霉變的情況，求診之前沒有使用過藥物，由此排除了中毒等原因造成蛋雞出現此癥狀的可能性，初步懷疑蛋雞出現此癥狀是傳染病造成的。再結合臨床癥狀和病理剖檢結果，篩選出細菌、禽流感、新城疫和禽白血病四個可疑病因。

2.3 細菌分離鑒定結果

培養24 h 后，發現普通瓊脂板上并無菌落，所以排除細菌的感染。

2.4 AIV 和NDV 的PCR 檢測結果

應用RT-PCR 方法進行禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）檢測，結果在條帶大小為460 bp 附近沒有擴增出片段（見圖1）。所以排除AIV 和NDV 的感染。

圖1 禽流感病毒新城疫病毒PCR 產物電泳圖

2.5 ALV-J PCR 的檢測結果

應用PCR 方法進行禽白血病病毒的檢測，結果擴增出目的片段968 bp（見圖2）。可以進一步懷疑該病毒為ALV-J。

圖2 禽白血病病毒PCR 產物電泳圖

2.6 序列分析

將禽白血病病毒PCR 產物送上海生物公司測序：將測得的序列與NCBI 網站上基因序列進行同源性比對（見表4）。

表4 J亞群禽白血病病毒DNA序列比對結果

由表4 可知，該檢測病樣DNA 序列與多株J 亞群禽白血病病毒DNA 序列同源性達99%，確定該病為禽白血病。

2.7 病因確定和處置

綜上所述，可以確定該雞場蛋雞是由ALV-J 感染所引起的，無細菌和AIV 以及NDV 感染。建議從以下幾個方面來預防：①保證充足的飼養密度；②提供合理的營養，保證雞群的正常生長和免疫系統的充分發育；③淘汰病雞，防止正常雞受到感染；④防止雞群的垂直傳播和水平傳播，種蛋孵化應選擇健康、不帶毒的孵化雞苗；及時清理病雞和可疑雞的排泄物和分泌物。

3 討論

從臨床上觀察病雞，可見縮頸，雞冠蒼白皺縮，食欲不振，精神沉郁，極度消瘦，排灰色稀狀糞便。病情嚴重的蛋雞甚至不能站立。對病死雞進行解剖，可見極度消瘦，龍骨發育不全，全身性貧血，主要病變情況有肝臟腫脹，脾臟腫脹，心冠狀脂肪消失，心臟腫瘤，肌肉腫瘤，腎臟腫瘤，肌胃腫瘤。由此我們可以初步推斷出是ALV-J感染，或者與其他病菌混合感染，所以我們要進行多方面的檢測來確定確切病因。首先我們進行了細菌的分離與鑒定[4]，發現并無細菌感染，其次我們對病料進行了AIV 和NDV 的PCR 檢測，病毒經引物進行特異性PCR 擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖可以看出AIV 和NDV 為陰性，由此我們可以判斷此病例沒有AIV 和NDV 的混合感染。

最后對ALV-J 進行了PCR 檢測，在PCR 檢測中，利用Marker（2 000 bp）陽性對照與陰性對照作為對照，從結果來看，被檢病樣DNA 大小均為968 bp 左右，將PCR 產物和rDNA 引物送至上海生物公司進行測序后與NCBI 進行對比分析發現，該病樣與ALV-J有99%的同源性，確定該病為J 亞群禽白血病。

3.1 禽白血病易發原因

禽白血病易發離不開它的垂直傳播；雞場如若從帶有禽白血病的種雞場接種，從而孵化出帶毒的雞苗，使得禽白血病在雞群中世代存在提供了途徑。

其次，禽白血病的水平傳播是該病易發的主要傳播方式[5]；雞群在狹小的飼養空間里，正常雞很容易直接接觸病雞，且病雞的排泄物和分泌物也很容易被病雞所接觸，這給禽白血病的水平傳播提供了便捷的途徑。

再而，我國某些地方種雞本身就帶有禽白血病，畜主如若沒有及時發現并淘汰，此種雞便會成為傳染源，讓禽白血病肆意傳播。另一方面，如若疫苗受到禽白血病感染，然后將受污染的疫苗接種于雞群上，整個雞群將感染禽白血病，后果不堪設想。

禽白血病易發主要的原因還是種雞群凈化不徹底，無法控制傳染源，導致大量流行；如果不從源頭來預防禽白血病，禽白血病將屢禁不止。

3.2 禽白血病的預防

預防禽白血病主要還是種雞群凈化，畜主應當做好以下幾個方面：

①防止垂直傳播。畜主應當從沒感染禽白血病的種雞場接種，從而孵化出不帶毒、健康的雞苗；這樣可以從種源處杜絕污染，給雞群提供了可持續發展的道路；②防止水平傳播。畜主應當時刻關注雞群，發現病雞或可以排下的糞便或分泌物應及時采取堆漚、生物發酵、消毒等手段，來殺死病毒[6]；③防止疫苗污染。在制造疫苗過程中，應防止疫苗被禽白血病毒（ALV）感染，否則接種疫苗后將引起大規模的蛋雞發病，后果不堪設想，因此，雞場應選用品質有保證的疫苗；④凈化環境與消毒。對雞舍定期進行高溫消毒，用酸性消毒劑噴灑消毒，可大量殺死病原，減少禽白血病發病率；⑤加強飼養管理。對產蛋前后的易感群采取主動保護措施，關注外界環境對雞群的影響。飼喂品質可靠的飼料，及時清理發霉、變質的飼料，保證雞群的正常生長和免疫系統的充分發育，合理添加維生素和微量元素來增強雞群的免疫力[7]；⑥保證充足的飼養密度。合理區分雞群，保證雞群不同大小個體不同欄舍等。保證充足的飼養密度，防止雞群擠在一起生活，隨著蛋雞的生長發育，畜主應當適當調整雞舍的大小來減少禽白血病的發病率。

4 結論

1）從安康嵐皋某雞場的病雞中提取出病料，進行細菌的分離與鑒定和AIV 和NDV 的PCR 檢測，結果發現并無禽流感病毒和新城疫病毒的感染，且無細菌感染。

2）從接種病料中設計出一對針對ALV-J 的特異性引物，進行擴增，獲得一個長度為968bP 的片段，與預期片段大小相符。

3）經序列分析，該檢測病樣DNA 序列與J 亞群禽白血病病毒DNA 序列同源性達99%，表明該病為禽白血病?！?/p>